研究背景细胞内ROS（reactive oxygen species）的产生处于动态平衡状态。缺血再灌注时细胞内产生大量的ROS，造成氧化应激损伤，即缺血再灌注损伤。轻度短暂的组织缺血再灌注可以减轻随后发生的严重的组织缺血再灌注损伤，这种现象称为缺血预适应（Ischemic preconditioning，IPC）。研究发现，创伤小，操作方便的肢体缺血预适应（Limb ischemic preconditioning, LIPC），可以减轻多种动物多个器官的缺血再灌注损伤。血液中ROS增加,易导致内皮损伤,加重缺血再灌注损伤。LIPC可以调节正常内皮功能，对内皮ROS损伤是否有作用目前尚无详细报道。CAT，SOD，GSH-Px等是细胞内重要的清除ROS的抗氧化酶。细胞内的抗氧化酶受到转录因子Nrf2（NF-E2-related factor2）的调控。Nrf2通过与抗氧化反应元件（Antioxiant response element, ARE）结合，上调与ARE相关的抗氧化基因表达，包括细胞内源性抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶等，清除细胞内过多地ROS，维持细胞内氧化还原水平，减轻氧化应激所造成的细胞损伤。受Nrf2调控的蛋白持续表达增加对细胞氧化还原内环境的稳定起到非常关键的作用。研究目的本课题主要观察LIPC大鼠的血清是否可以减轻H₂O₂所导致的人脐静脉内皮细胞HUVEC和鼠胚胎心肌细胞H9c2（2-1）的氧化应激损伤，分析Nrf2所调控的抗氧化基因是否参与了该过程，以及有可能所涉及的信号通路。材料和方法（1）成年健康SD大鼠，用改良的大鼠尾动脉血压测定仪套管套在大鼠右后肢，加压至200mmHg阻断股动脉造成右后肢短暂缺血，持续5分钟，放气减压恢复血流，持续10分钟，共3个循环。预适应结束后立即腹主动脉无菌采血获得大鼠早期肢体预适应血清。预适应后间隔24小时采血，获得大鼠延迟肢体预适应血清，分装冻存于-80℃。（2）建立HUVEC和H9c2（2-1）细胞的H₂O₂损伤模型，参考IC50作为后续实验造模浓度。HUVEC和H9c2（2-1）细胞分为5组，对照组（control，C），模型组（model，M），大鼠早期预适应血清组（preconditioning serum, PS），大鼠延迟预适应血清组（delayed preconditioning serum, DPS），正常大鼠血清组（normal rat serum, NRS），预先用2.5%,5%（V/V）各种血清孵育6小时和12小时，然后用H₂O₂处理2小时，用MTT法检测各种血清预处理对HUVEC和H9c2（2-1）细胞活性的影响。（3）应用AnnexinV-FITC和PI双染进一步检测细胞的凋亡情况。（4）细胞处理完成后，用8μM的DHE孵育45分钟，荧光显微镜下检测ROS的含量。（5）应用LDH，MDA，CK检测试剂盒检测细胞培养上清液中LDH，CK的活性及MDA的浓度。（6）采用SOD，CAT，GSH-Px检测试剂盒检测细胞培养上清液中SOD，CAT，GSH-Px的活性。（7）采用免疫荧光法和激光共聚焦显微镜检测各组细胞Nrf2的核转位情况。（8）采用real-time RT-PCR检测各组细胞中抗氧化基因CAT，HO-1，SOD1，SOD2，GSH-Px1mRNA的水平。（9）采用Western Blot法检测各组细胞中CAT，HO-1，SOD1，SOD2的蛋白表达情况。（10）用25μM PI3K的抑制剂LY294002和26μM MEK1/2抑制剂U0126提前1小时处理细胞，观察这两种抑制剂对PS和DPS作用的影响。（11）各实验组数据采用mean±SD表示，利用SPSS13.0统计软件分析，组间差异比较采用单因素方差分析。P <0.05认为有显著差异。结果（1）不同浓度的H₂O₂（100-1200μM）作用2小时后，随H₂O₂浓度增高HUVEC和H9c2（2-1）细胞存活逐渐降低，IC50分别为1099.56±109.11μM和380.98±57.44μM，参考IC50选取1000μM和400μM作为造模浓度。（2）对于H9c2（2-1）细胞和HUVEC细胞，2.5%PS，DPS，NRS预孵育6小时和12小时，400μM和1000μM H₂O₂处理2小时，MTT570nm处吸光度测定结果显示，M组比C组显著降低（P <0.001），PS，DPS，NRS组的吸光度与M组相比无显著差异（P>0.05）。（3）5%的各血清预孵育6小时，400μM和1000μM H₂O₂处理2小时，H9c2（2-1）细胞和HUVEC细胞MTT570nm处吸光度测定结果显示，M组比C组显著降低（P <0.001）。PS，DPS，NRS组的吸光度与M组相比无显著差异（P>0.05）。（4）5%的各血清预孵育12小时，H₂O₂处理2小时，MTT570nm处吸光度测定结果显示，H9c2（2-1）M组吸光度显著低于C组（0.51±0.03vs1.20±0.09，P <0.001），PS组和DPS组吸光度分别为1.14±0.17和1.08±0.23，显著高于M组（P<0.001），PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。NRS组吸光度0.53±0.04，与M组相比无显著性差异（P>0.05）。HUVEC细胞M组吸光度显著低于C组（0.78±0.03vs1.26±0.06，P <0.001），PS组和DPS组吸光度分别为1.09±0.04和1.08±0.04，显著高于比M组（P <0.001），PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。NRS组吸光度0.75±0.03，与M组相比无显著性差异（P>0.05）。（5）5%的各血清预孵育12小时，H₂O₂处理2小时，H9c2（2-1）细胞PS组、DPS组和M组的早期凋亡率分别为2.74±1.28%、5.22±2.09%和12.28±3.24%（P <0.001，P <0.05）；PS组、DPS组和M组晚期凋亡率分别为6.87±0.88%，8.90±0.65%和36.04±6.22%（P <0.001）；PS组、DPS组和M组总死亡率为9.61±0.93%，14.12±1.43%，48.31±3.33%（P <0.001）。PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。NRS组的早期凋亡，晚期凋亡和总死亡率与M组比较无显著差异（P>0.05）。HUVEC细胞PS组、DPS组的早期凋亡率分别为1.12±0.20%、1.78±0.20%与M组13.24±1.37%相比，显著降低（P<0.01）；PS组和DPS组晚期凋亡率7.54±1.49%和6.87±1.48%，与M组晚期凋亡率25.52±0.86%相比，显著降低（P <0.001，P <0.01）；PS组和DPS组总死亡率为8.65±1.67%和9.65±1.44%，与M组总死亡率38.76±2.23%相比，显著降低（P <0.001）。PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。NRS组的早期凋亡率，晚期凋亡率和总死亡率与M组比无显著差异（P>0.05）。（6）5%的各血清预孵育12小时，H₂O₂处理2小时，H9c2（2-1）细胞M组荧光亮度与C组比显著升高（96.34±21.23vs23.67±6.5，P <0.01）。PS组和DPS组荧光亮度29.87±5.67和30.67±7.34比M组显著降低（P <0.01）。PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。NRS组荧光亮度为88.67±19.21，与M组相比无显著性差异（P>0.05）。HUVEC细胞M组荧光亮度76.34±19.23比C组20.16±4.5显著升高（P <0.01）。PS组和DPS组荧光亮度22.87±6.78和24.46±8.12比M组显著降低（P<0.01）。PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。NRS组荧光亮度为71.34±16.19，与M组比无显著性差异（P>0.05）。（7）5%的各血清预孵育12小时，H₂O₂处理2小时，H9c2（2-1）细胞M组MDA浓度从4.42±0.28nmol/ml升高至8.74±0.33nmol/ml（P <0.001）。PS组和DPS组MDA浓度则降至3.48±0.46nmol/ml和3.55±0.68nmol/m（lP <0.001），PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。而NRS组的MDA为8.54±1.08nmol/ml，与M组比无显著差异（P>0.05）。HUVEC细胞M组MDA浓度从4.86±0.28nmol/ml升高至6.67±0.29nmol/ml（P <0.001）。而PS组和DPS组MDA浓度则降至3.44±0.27nmol/ml，3.80±0.42nmol/ml（P<0.001），PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。NRS组的MDA浓度为6.25±0.59nmol/ml，与M组比无显著差异（P>0.05）。5%的各血清预孵育12小时，H₂O₂处理2小时，H9c2（2-1）细胞的LDH浓度从72.69±6.75U/L升高至191.93±36.52U/L（P <0.001）；PS组和DPS组LDH则降至77.81±13.58U/L，105.75±8.67U/L（P <0.001），PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。而NRS组的LDH为173.86±36.17U/L，与M组比无显著差异（P>0.05）。HUVEC细胞的LDH含量12.58±2.74U/L升高至58.16±5.05U/L（P <0.001）。而PS组和DPS组LDH则降至16.51±4.63U/L和15.54±2.70U/L（P <0.001）。PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。而NRS组的LDH为62.13±11.95U/L，与M组比无显著差异（P>0.05）。400μM H₂O₂处理H9c2（2-1）细胞2小时，细胞培养液中的CK显著升高（15.67±0.91U/L vs30.47±1.76U/L，P <0.001），PS和DPS预先处理12小时，则细胞培养液中的CK降低至20.08±1.26U/L和22.00±1.52U/L（P <0.001）。PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。NRS预先处理12小时，则细胞培养液中的CK为29.47±2.26U/L，与M组30.47±1.76U/L相比，无显著差异（P>0.05）。（8）5%的各血清预孵育12小时，H₂O₂处理2小时，H9c2（2-1）细胞CAT的活性PS组和DPS组为45.33±3.82U/ml和44.61±5.79U/ml比M组17.30±1.62U/ml显著增高（P <0.01，P <0.05），PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。NRS组为17.92±2.17U/ml，与M组比无显著差异（P>0.05）。HUVEC细胞CAT的活性PS组和DPS组为51.25±4.82U/ml和50.5±5.89U/ml比M组21.69±2.02U/ml高（P <0.01,P <0.05），PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。NRS组为25.81±4.40U/ml，与M组比无显著差异（P>0.05）。H9c2（2-1）细胞SOD的活性PS组和DPS组为14.02±1.68U/ml和14.11±0.58U/ml，比M组6.89±0.97U/ml显著增高（P <0.001），PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。NRS组为7.56±1.24U/ml，与M组比无显著差异（P>0.05）。HUVEC细胞CAT的活性PS组和DPS组为13.82±0.50U/ml，11.29±3.58U/ml比M组6.43±0.78U/ml显著增高（P <0.001，P <0.05），PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。NRS组为7.74±2.02U/ml，与M组比无显著差异（P>0.05）。H9c2（2-1）细胞GSH-Px的活性PS组和DPS组为43.27±8.56U/ml，37.62±6.00U/ml，比M组15.06±7.09U/ml显著增高（P <0.01），PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。NRS组为21.89±3.97U/ml，与M组比无显著差异（P>0.05）。HUVEC细胞GSH-Px的活性PS组和DPS组为52.38±15.75U/ml，41.84±1.66U/ml比M组25.08±8.50U/ml显著增高（P <0.001，P <0.05），PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。NRS组为29.34±8.56U/ml，与M组比无显著差异（P>0.05）。（9）H9c2（2-1）细胞和HUVEC各组细胞Nrf2的分布情况，C组细胞内的绿色荧光（anti–Nrf2-FITC）主要在核周围，呈环状。NRS组和M组只有少量细胞中的Nrf2从细胞浆进入细胞核。而PS组和DPS组中，大量细胞中的Nrf2从细胞浆进入细胞核，PS组和DPS组Nrf2的核转位增多。（10）H9c2（2-1）细胞M，NRS，PS，DPS组的CAT，HO-1，SOD1，SOD2，GSH-Px1的mRNA水平都比C组增高，但NRS组与M组比无显著差异（P>0.05）。CAT的mRNA水平PS组3.12±0.03和DPS组2.63±0.13比M组1.23±0.04显著增高（P <0.001）。HO-1的mRNA水平PS组4.10±0.26和DPS组3.26±0.21比M组1.30±0.02显著增高（P <0.001）。SOD1的mRNA水平PS组3.74±0.37和DPS组3.89±0.84比M组1.58±0.07显著增高（P <0.001）。SOD2的mRNA水平PS组4.04±0.22和DPS4.34±0.22组比M组1.52±0.11显著增高（P <0.001）。GSH-Px1的mRNA水平PS组3.17±0.17和DPS组4.86±0.71比M组1.58±0.12显著增高（P <0.001）。PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。HUVEC细胞M，NRS，PS，DPS组的CAT，HO-1，SOD1，SOD2，GSH-Px1的mRNA水平都比C组增高，但NRS组与M组比无显著差异（P>0.05）。CAT的mRNA水平PS组3.35±0.03和DPS组2.86±0.13比M组1.46±0.04显著增高（P <0.05）。HO-1的mRNA水平PS组4.51±0.26和DPS组3.67±0.21比M组1.71±0.02显著增高（P <0.001）。SOD1的mRNA水平PS组4.15±0.37和DPS组4.30±0.84比M组1.99±0.07显著增高（P <0.001）。SOD2的mRNA水平PS组3.84±0.22和DPS组4.14±0.22比M组1.32±0.11显著增高（P <0.001）。GSH-Px1的mRNA水平PS组1.97±0.17和DPS组4.66±0.71比M组1.38±0.12显著增高（P <0.05，P<0.001）。PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。Western Blot检测结果，H9c2（2-1）细胞，PS组和DPS组细胞内的抗氧化酶CAT（0.56±0.08,0.53±0.07），HO-1（0.46±0.07,0.44±0.01），SOD1（0.55±0.09,0.61±0.08），SOD（20.47±0.06,0.52±0.07），表达显著增高（M组CAT0.32±0.09，HO-10.29±0.03, SOD10.35±0.05,SOD20.27±0.05，P <0.05），PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。而NRS组抗氧化酶的表达与M相比无显著差异（P>0.05）。Western Blot检测结果，HUVEC细胞，PS组和DPS组细胞内的抗氧化酶CAT（0.63±0.10,0.62±0.07），HO-1（0.58±0.10,0.60±0.04），SOD1（0.41±0.11,0.54±0.09），SOD2（0.54±0.09,0.51±0.02）表达增高（M组CAT0.33±0.09，HO-10.31±0.05, SOD10.27±0.1,SOD20.28±0.05, P <0.05），PS组和DPS组相比无显著差异（P>0.05）。NRS组抗氧化酶的表达与M相比无显著差异（P>0.05）。（11）H9c2（2-1）细胞PS组的吸光度为1.09±0.1，而PS+LY294002组吸光度为0.95±0.15，PS+U0126组吸光度为1.12±0.19，与PS组比无显著差异（P>0.05）。DPS组的吸光度为1.02±0.15，而DPS+LY294002组吸光度为0.99±0.11，DPS+U0126组吸光度为0.95±0.14，与DPS组比无显著差异（P>0.05）。HUVEC细胞PS组的吸光度为1.58±0.08，而PS+LY294002组吸光度为1.51±0.06，PS+U0126组吸光度为1.45±0.12，与PS比无显著差异（P>0.05）。DPS组的吸光度为1.51±0.06，而DPS+LY294002组吸光度为1.52±0.06，DPS+U0126组吸光度为1.48±0.02，与DPS组比无显著差异（P>0.05）。LY294002和U0126不影响PS和DPS对H9c2（2-1）细胞和HUVEC细胞H₂O₂损伤的保护作用，不影响Nrf2的核转位。结论肢体缺血预适应大鼠早期相和晚期相血清，5%孵育12小时，能够减轻H₂O₂所造成的H9c2（2-1）细胞和HUVEC细胞损伤，增加Nrf2的核转位，从而提高CAT，HO-1，SOD1，SOD2，GSH-Px1的mRNA水平，CAT，HO-1，SOD1，SOD2蛋白表达增加，抗氧化酶CAT，SOD，GSH-Px的活性增高。PI3K/AKT通路和MEK/ERK1/2通路可能不参与其中。