论文部分内容阅读
目的：首先在ICR小鼠中建立皮内注射糖代谢中间产物Methylglyoxal（MGO）诱导的急性痒和触诱发痒动物模型，采用药理学、行为学方法、活细胞成像、分子细胞生物学等技术，来探究MGO诱导瘙痒的分子机制。其次，建立链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠模型，检测糖尿病小鼠的自发痒、化学刺激诱发痒和触诱发痒等行为学变化。通过药理学、行为学、分子生物学等方法，探究MGO信号通路调控糖尿病小鼠相关瘙痒和痛阈变化的分子机制。 方法： （1）将雄性成年ICR小鼠分别在脸颊和颈背部注射不同剂量的MGO，观察并定量分析小鼠的瘙痒或疼痛行为。 （2）应用药理学方法阻断C纤维、耗竭肥大细胞，施加吗啡、纳洛酮、扑尔敏、U0126、MGO清除剂、T型钙通道阻断剂、TRPA1、TRPV1阻断剂等，以及TRPV1和TRPA1基因敲除小鼠研究MGO诱导急性瘙痒的分子机制。鞘内注射MGO清除剂、TRPA1、TRPV1阻断剂等研究MGO诱导痛阈变化的分子机制。 （3）应用Western blotting技术确定MGO孵育ND7-23 DRG细胞系后p-ERK的磷酸化变化情况。皮内单独注射MGO、混合皮内注射TRPA1、TRPV1阻断剂或提前30 min腹腔注射抗氧化剂NAC、PBN后再皮内注射MGO，在5min内取小鼠脊髓和DRG组织，应用Western blotting技术检测其p-ERK的表达变化情况。 （4）运用流式细胞技术，研究MGO引起ND7-23细胞系胞内活性氧（ROS）升高的机制。 （5）单次腹腔注射STZ（100mg/kg）诱导糖尿病模型，观察造模后一周至五周的自发痒、化学刺激诱发痒、触诱发痒及痛阈变化情况，运用MGO清除剂、TRPA1、TRPV1阻断剂等观察对触诱发痒及痛阈的影响。 （6）应用荧光定量PCR技术和Western blotting技术，检测糖尿病小鼠TRPA1、TRPV1的表达变化情况。 （7）体外培养HEK-293细胞系，分别转染TRPV1和TRPA1质粒，应用免疫荧光技术确定转染成功，然后应用活细胞工作站技术，检测胞内钙离子浓度，确定MGO对TRPV1和TRPA1的调控作用。 结果： （1）在脸颊模型和颈背部模型中，皮内注射MGO能诱发小鼠剂量依赖的搔抓行为以及触诱发痒的行为。 （2）行为药理学结果显示，阻断C纤维、耗竭肥大细胞、皮内注射纳洛酮、扑尔敏、MGO清除剂等可以明显抑制MGO诱导的急性瘙抓（P<0.05）。皮内注射MGO清除剂可以显著抑制MGO诱导的触诱发痒（P<0.05）； （3）活细胞成像显示，MGO能够引起TRPA1转染HEK293细胞的胞内钙浓度升高（P<0.05），而不影响TRPV1转染HEK293细胞的胞内钙浓度（P>0.05），提示MGO选择性激活TRPA1通道。 （4）行为学结果显示，施加TRPA1阻断剂HC030031或A967079可以显著抑制MGO诱导的急性瘙抓（P<0.05）以及触诱发痒行为（P<0.05），而施加TRPV1阻断剂capsazepine（CPZ）无效（P>0.05）。此外，MGO诱导的急性瘙抓在Trpa1基因敲除小鼠大幅降低（P<0.05），但是Trpv1基因敲除小鼠没有明显变化（P>0.05）。 （5）皮内注射MGO诱导脊髓和DRG组织p-ERK表达升高（P<0.05）。施加TRPA1阻断剂HC030031能明显降低p-ERK在脊髓的表达（P<0.05），而TRPV1阻断剂CPZ无效（P>0.05）。 （6）MGO能诱导DRG细胞系ND7-23细胞的胞内ROS的升高（P<0.05），而抗氧化剂PBN可以抑制MGO引起的ROS升高（P<0.05）。行为学结果表明，提前半小时腹腔注射抗氧化剂PBN或NAC都能明显降低MGO诱导的急性搔抓行为（P<0.05）以及p-ERK在脊髓的表达（P<0.05）。 （7）STZ诱导的糖尿病小鼠无明显自发痒，化学刺激诱发痒行为降低（P<0.05），但触诱发痒行为明显增加（P<0.05）。MGO清除剂、TRPA1阻断剂而非TRPV1阻断剂，可以有效缓解糖尿病小鼠触诱发痒的行为（P<0.05）。 （8）糖尿病小鼠DRG组织TRPV1的mRNA表达显著降低（P<0.05），TRPA1的mRNA及蛋白表达都显著升高（P<0.05）。 （9）糖尿病小鼠的热痛阈明显升高（P<0.05）。鞘内注射MGO清除剂、TRPA1阻断剂HC030031而非TRPV1阻断剂CPZ，可以显著抑制糖尿病诱导的小鼠热痛阈升高（P<0.05）。系统或鞘内注射MGO能引起正常小鼠热痛阈升高（P<0.05）。鞘内注射MGO清除剂、TRPA1阻断剂HC030031而非TRPV1阻断剂CPZ明显抑制MGO诱导的小鼠热痛阈的升高（P<0.05）。 结论： （1）糖代谢中间产物MGO能诱导小鼠急性瘙痒和触诱发痒的行为。 （2）TRPA1激活，而不是TRPV1，在MGO诱发DRG神经元胞内钙浓度升高以及急性瘙痒和触诱发痒的行为中起关键作用。 （3）MGO诱导小鼠脊髓和DRG组织p-ERK的激活，并且pERK激活在MGO诱导的急性瘙痒行为中发挥重要作用。 （4）氧化应激在MGO诱导急性瘙痒中以及p-ERK表达中发挥重要作用。 （5）糖尿病小鼠触诱发痒行为增加，MGO-TRPA1-pERK信号通路在其中发挥重要作用。 （6）糖尿病小鼠的热痛阈升高，可能与MGO激活脊髓水平TRPA1通道有关。