【摘 要】
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第一部分慢性肝病患者尿源性干细胞的生物学特性及对肝损伤小鼠的治疗作用目的:比较健康人群尿源性干细胞（Urine-derived stem cells from normal individuals,N-USCs）与慢性肝病患者尿源性干细胞（Urine-derived stem cells from patients with chronic liver disease,LD-USCs）的体外生物学
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第一部分慢性肝病患者尿源性干细胞的生物学特性及对肝损伤小鼠的治疗作用目的:比较健康人群尿源性干细胞（Urine-derived stem cells from normal individuals,N-USCs）与慢性肝病患者尿源性干细胞（Urine-derived stem cells from patients with chronic liver disease,LD-USCs）的体外生物学特性及对肝损伤小鼠的肝脏修复作用,以明确LD-USCs的生物学性状是否受到肝脏疾病状态的影响。方法:（1）分离、扩增、培养N-USCs与LD-USCs。克隆形成实验检测原代细胞活力及增殖能力;流式细胞术鉴定细胞表面标志物;细胞群体倍增量（PD）及倍增时间（DT）检测USCs体外增殖能力;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;划痕及Transwell实验检测细胞迁移能力;碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）染色、茜素红S染色、阿利新蓝染色及油红O染色分别对细胞早期成骨能力、晚期成骨能力、成软骨能力及成脂肪能力进行鉴定。（2）腹腔注射CCl4诱导小鼠急性或慢性肝损伤模型,N-USCs及LD-USCs通过尾静脉分别移植入肝损伤裸鼠体内。测定肝脏指数、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平;肝脏病理组织切片进行HE染色、Masson染色分别观察肝组织细胞损伤情况及纤维化水平;免疫组织化学法检测纤维化蛋白α-SMA（α-smooth muscle actin）表达水平及氧化应激相关蛋白8-OHd G（8-Hydroxydeoxyguanosine）与MPO（Myeloperoxidase）的水平。结果:（1）克隆形成实验结果显示两种USCs原代细胞的活力无明显差异。N-USCs与LD-USCs均呈米粒样或纺锤样形态并且表达CD24-FITC、CD29-PE、CD73-PE、CD90-PE及CD146-PE,而不表达CD31-FITC、CD34-PE、CD45-FITC及CD105-FITC;两组USCs显示出相似的细胞增殖、克隆形成、凋亡与迁移能力;经不同条件培养基分化诱导后可见,两组USCs中30%-40%细胞碱性磷酸酶染色阳性、约20%细胞茜素红S染色阳性、几乎所有细胞阿利新蓝染色阳性以及45%-50%细胞油红O染色呈阳性,N-USCs与LD-USCs的多向分化能力未观察到明显差异。（2）USCs移植入急性和慢性肝损伤小鼠模型后,肝脏指数、ALT及AST水平较模型组均有不同程度降低,且N-USCs与LD-USCs组间未观察到明显差异;HE与Masson染色结果显示,USCs移植组小鼠肝损伤部位的组织结构明显改善,纤维化程度减轻且LD-USCs显示出与N-USCs相似的肝损伤修复能力;免疫组织化学染色中,两移植组的纤维化标志物α-SMA及氧化应激相关蛋白8-OHd G及MPO表达量较模型组均有下降,且三种蛋白表达水平在N-USCs与LD-USCs组中未观察到明显差异。结论:LD-USCs在体外实验中显示出与N-USCs相似的增殖、迁移、凋亡及多向分化能力,移植入急性或慢性肝损伤小鼠体内,可有效改善受损肝脏组织和功能。提示LD-USCs的生物学特性并未受到肝脏疾病的影响。第二部分低氧促进尿源性干细胞与肝细胞融合的作用研究目的:探讨低氧对USCs细胞迁移及细胞融合的影响及可能的机制。方法:常氧（20%）或低氧（3%）条件下培养尿源性干细胞（Urine derived stem cells,USCs）48h,应用划痕实验与Transwell实验检测USCs的迁移能力;免疫荧光法及流式细胞术测定USCs与肝细胞HP14-19或Hep G2的细胞融合率;透射电子显微镜（TEM）下观察细胞骨架结构;免疫荧光、流式细胞术及Real-time PCR检测细胞极性相关蛋白Rho A、Cdc42及Rac1的表达。结果:与常氧组USCs相比,低氧组USCs的迁移能力及与HP14-19或Hep G2细胞融合率明显增高。透射电子显微镜结果可见低氧预处理USCs后细胞骨架重塑,微丝微管排列规律。免疫荧光、流式细胞术及Real-time PCR结果提示,低氧组USCs极性相关蛋白Rho A、Cdc42及Rac1的表达较常氧组明显增加。结论:低氧预处理USCs可增强细胞的迁移及融合能力,其机制可能与细胞骨架的重塑和细胞极性上调有关。
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