茶氨酸是茶叶中特有的氨基酸,具有很高的医用价值和商业价值,但由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸,成本高昂。因此,开展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理论意义和实践价值。本研究的主要目的是筛选得到可合成茶氨酸的微生物菌株,并对该菌株的培养、生物合成茶氨酸的条件以及茶氨酸合成关键酶类的基因克隆和表达等进行研究,以期为今后利用微生物发酵和基因工程的方法工业化生产茶氨酸提供理论依据。主要研究结果如下: 1.从6种含有谷氨酰胺酶的微生物中筛选得到一株可以合成茶氨酸的微生物菌株—硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)。 2.培养研究表明,该硝基还原假单胞菌在丰富盐离子培养基中7小时以后进入对数生长期,18小时以后进入稳定期。其最佳培养条件是:培养基pH7.0、培养温度30℃、1%葡萄糖为C源、0.6%谷氨酸钠为N源、自然通气量、装液量30—40%。该菌株在传代10次时基本保持稳定,传代40次时出现不稳定性质。 3.摇瓶实验结果表明,硝基还原假单胞菌生物合成茶氨酸的最佳条件为:底物浓度0.3M谷氨酰胺/1.5M乙胺、pH9.5、湿细胞量70mg/ml,培养温度30℃,培养时间24小时。此时,茶氨酸的最大生成量为24.10g/L。底物浓度0.7M谷氨酰胺/1.4M乙胺、pH9.5、湿细胞量70mg/ml,培养温度30℃,培养时间24小时。此时,茶氨酸的最大生成量为41.38g/L。发酵小试结果表明,该条件下发酵10小时,茶氨酸生成量达到最大值为22.52g/L;60小时发酵终点时,发酵液中茶氨酸平均含量为15.01g/L。 4.试图克隆硝基还原假单胞菌中谷氨酰胺酶的基因。由基因测序可知,克隆得到的基因序列与已GenBank报道的假单胞菌的谷氨酰胺酶基因序列同源性很低。其原因有待于进一步研究。 5.本实验成功克隆、表达了E.coli中的谷胺酰氨转肽酶基因;所得基因工程菌在底物浓度0.3M谷氨酰胺/1.5M乙胺、pH9.5、湿细胞量70mg/ml,培养温度30℃,培养24小时,茶氨酸的最大生成量为9.00g/L。