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抗病(resistance,R)基因是植物先天免疫的重要组成部分,也是作物育种中极重要的遗传资源。植物的绝大多数R基因编码NLR(nucleotide-binding,leucine-rich-repeat domain-containing)蛋白,用于感受入侵病原菌的效应因子(effector),以引发强烈的免疫反应,从而阻止病原菌生长。R基因的免疫机理是植物生物学研究的一个重要领域,但由其引发的免疫信号传导通路长期以来缺乏一个普遍的认识。水稻(Oryza sativa)是全球主要的粮食作物之一。稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻最严重的病害之一。水稻中迄今已克隆了20多个与稻瘟病相关的R基因,其中多数编码CNL(CC-NLR)蛋白。稻瘟病菌与水稻的相互作用为探究R基因介导的防御信号传导研究提供了很大的便利。在本论文的前期研究中,已经证实了水稻R基因PID3引发的稻瘟病抗性反应依赖于小G蛋白Os Rac1和下游b HLH(basic helix-loophelix)类转录因子RAI1(Rac immunity1)组成的信号传导链;Os Rac1及其上游鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)Os SPK1在另两个R基因Pit及Pia的免疫反应中的作用也获得了验证。本研究以两个在稻瘟病抗谱上差异较大的R基因PID3和Pi9为例,分别检验Os Rac1及其上下游元件Os SPK1、RAI1在这两个R基因介导的免疫反应中的作用,探索水稻R基因下游一条保守的信号通路,同时还初步探讨了RAI1的表达调控机制,结果如下:1)本研究首先在PID3-TL转基因材料背景下使Os SPK1基因沉默,从遗传学上验证了PID3的稻瘟病抗性同样依赖于Os SPK1;通过GEF抑制剂处理共表达PID3和Os Rac1的水稻原生质体,发现受诱发的细胞死亡数量明显减少,证明Os Rac1在PID3下游的作用依赖于Os SPK1;同时,酵母双杂交(yeast two-hybridization,Y2H)实验还进一步显示PID3和Os SPK1间存在分子互作。由此本研究认为,在PID3对稻瘟病菌的免疫应答中,Os SPK1、Os Rac1和RAI1组成了一条主要的防御信号传导路径。2)鉴于PID3和Pit的相对窄谱抗性,本研究还在稻瘟病抗谱更广、同时与前二者在进化关系上距离较远的R基因Pi9上对以上信号传导元件进行验证。通过在Pi9-TL转基因材料中分别构建Os SPK1和Os Rac1的基因沉默突变,证明了这两个组分同样为Pi9的稻瘟病抗性所必需;接着,通过RNA干扰以及嵌合抑制沉默实验,证明了RAI1对Pi9稻瘟病抗性的重要性;免疫印迹分析发现,Pi9-TL相比稻瘟病易感的背景材料TP309,其体内RAI1水平在侵染前期被快速诱导,而在后期维持较高水平,表明Pi9可能通过影响RAI1的蛋白水平而发挥作用;进一步地,Y2H和双分子荧光互补试验分别证明了Pi9与RAI1在细胞核内的互作;同时,酵母自激活检测和双荧光报告基因体系分别验证了RAI1的转录激活活性。由此表明,Os SPK1、Os Rac1和RAI1分别在水稻R基因PID3和Pi9的免疫体系中具有共通性,它们可能共同构成水稻R基因介导的一条保守的信号传导途径。3)作为具有转录激活活性又是R基因介导抗性的重要调控因子,本研究还对RAI1自身如何受控进行了初步的探究。利用酵母c DNA文库在水稻中鉴定到了RAI1的一个互作子OsRPT2a(regulatory particle AAA+ATPase 2a),它是水稻26S蛋白酶体19S调节组分上的一个亚基,Y2H试验验证了OsRPT2a的羧基末端与RAI1的互作关系;体外磷酸水平检测试验表明OsRPT2a具有一定的ATP水解酶活性;而对胞内分布的统计结果显示,OsRPT2a主要以聚集体形式分布于液泡和内质网腔中,少数在细胞核和胞质中定位,其亚细胞定位部分依赖于氨基端第二个保守的甘氨酸残基;OsRPT2a敲除突变导致水稻植株的抗病性丧失,显示该基因对植物免疫发挥正调控作用;进一步地,体内蛋白降解试验表明,OsRPT2a能够负调控RAI1在胞内的积累,而前者的ATP酶活丧失或在孵育体系中添加蛋白酶体抑制剂均能显著抑制这一调控作用,表明OsRPT2a以依赖于ATP酶活和蛋白酶体活性的方式介导RAI1的体内蛋白降解。本研究因此认为,OsRPT2a通过介导RAI1的表达调控,从而参与控制植物的抗病反应。上述结果表明了水稻NLR下游存在保守信号通路的可能,并初步验证了抗病下游元件RAI1的表达调控机制,为进一步揭示R基因介导的抗病机理提供了参考,同时对生产中的病害防治具有指导意义。