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背景:甲真菌病(onychomycosis)是甲板、甲床和甲周围组织的真菌感染,占所有甲疾病的50%和所有皮肤感染的10%,是最常见的指(趾)甲疾病。大约90%的甲真菌病由皮肤癣菌引起,而皮肤癣菌中的红色毛癣菌是引起甲真菌病的最主要的病原菌。集体生活中的官兵队伍中足癣、甲真菌病等浅部真菌病的发病率和复发率很高。目前针对甲真菌病的传统治疗方法存在疗效不好或者用药后发生不良反应的风险高等局限性,不适合孕妇、哺乳期妇女、肝肾功能障碍、药物不耐受的老年人、飞行员等特殊人群。随着激光医学的不断发展,激光治疗甲真菌病由于其安全、有效、无毒副作用等优势备受瞩目,长脉宽1064nmNd:YAG激光就是常用的治疗甲真菌病的激光设备之一。但也有一些研究发现使用不同脉宽(调Q、亚毫秒、毫秒)的1064nm Nd:YAG激光体外照射红色毛癣菌菌落,却未能抑制其生长,存在争议。而且激光治疗甲真菌病的具体机制尚不清楚。研究发现ROS和硝基化产物是抑制/杀灭红色毛癣菌生长的重要物质,在光动力疗法对红色毛癣菌的体外生长抑制作用中发挥作用。研究发现活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)介导的氧化应激反应是诱导真菌凋亡的主要方式之一。可猜测氧化应激是1064nm Nd:YAG激光治疗甲真菌病的机制之一。我们拟探讨该激光对红色毛癣菌的体外抑制/杀灭作用及氧化应激在其中发挥的作用。目的:1.探讨长脉宽1064nm Nd:YAG激光对红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)的体外抑制/杀灭作用;2.探讨活性氧簇(ROS)介导的氧化应激反应在长脉宽1064nm Nd:YAG激光体外对红色毛癣菌的抑制/杀灭作用中发挥的作用。方法:第一部分:长脉宽1064nm Nd:YAG激光体外对红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)的抑制/杀灭作用1.培养红色毛癣菌,制备平板菌落、孢子悬液,在长脉宽1064nm Nd:YAG激光其他参数固定的前提下改变脉冲数(0次脉冲、5次脉冲、9次脉冲、11次、13次、15次脉冲),分别照射红色毛癣菌菌落,观察红色毛癣菌菌落面积变化并绘制生长曲线,确定对菌落有抑制作用的脉冲数。2.以此脉冲数照射菌落,用乳酸酚棉兰和钙荧光白染色后在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察形态学改变。3.在长脉宽1064nm Nd:YAG激光其他参数固定的前提下,改变脉冲数(0次脉冲、5次脉冲、9次脉冲、11次脉冲),分别照射红色毛癣菌孢子悬液,比较不同脉冲照射6h后相对活力之间的差异,确定对相对活力有抑制作用的脉冲数,以此脉冲数干预孢子悬液,观察激光干预后相对活力随时间的变化。第二部分:氧化应激反应在长脉宽1064nm Nd:YAG激光对红色毛癣菌的抑制/杀灭作用中发挥的作用1.在长脉宽1064nm Nd:YAG激光其他参数固定的前提下,改变脉冲数(0次脉冲、5次脉冲、9次脉冲、11次脉冲),分别照射红色毛癣菌孢子悬液,装载DCFHDA探针,洗脱后在FITC处检测荧光度值,定量比较不同脉冲照射后ROS表达的差异。2.以对相对活力有抑制作用的脉冲数干预红色毛癣菌孢子悬液,装载洗脱DCFH-DA探针同上,用荧光显微镜下和光学显微镜对同一视野进行采图,定性观察并比较未照光和激光干预后荧光强度的变化。结果:1.长脉宽1064nm Nd:YAG激光体外对红色毛癣菌有抑制/杀灭作用,随脉冲数的增加,生长曲线和相对活力下降,呈能量依赖性;9次脉冲激光干预后菌丝膨胀粗糙,失去了正常菌丝纤细顺滑的形态;9次、11次脉冲数激光干预后孢子悬液的相对活力下降,低于未干预的孢子悬液(P<0.01),且低于5次激光干预后的相对活力(P<0.01);9次脉冲数激光干预后的相对活力随时间的增加而下降。2.不同脉冲数激光干预红色毛癣菌孢子悬液后,定量检测到ROS含量随着脉冲数的增加而增加。5次、9次、11次脉冲照射后的ROS含量增加,高于未照光的孢子悬液(P<0.01),11次脉冲ROS含量高于5次脉冲的ROS(P<0.01),也高于9次脉冲的ROS(P<0.01)。9次脉冲激光干预后,在荧光显微镜下可定性观察到红色毛癣菌孢子荧光强度高于未照光的孢子的荧光强度。结论:证实了长脉宽1064nm Nd:YAG激光在体外对红色毛癣菌的抑制和杀灭作用,同时激光干预后红色毛癣菌的ROS升高,相对活力下降,提示ROS介导的氧化应激反应可能在该激光治疗红色毛癣菌甲真菌病中发挥了一定的作用,为长脉宽1064nmNd:YAG激光临床治疗甲真菌病提供理论基础。