本课题应用组织工程技术，构建组织工程化尿道海绵体，移植修复兔海绵体尿道(尿道海绵体和尿道的简称)缺损，探索构建组织工程化尿道海绵体的方法和技术。实验内容分为以下三个部分： 1.兔脱细胞尿道海绵体-尿道基质(CS-UECM)的制备。 2.种子细胞的获取、扩增及标记。包括三种种子细胞。 1)尿道海绵体平滑肌细胞(CSMC)的原代培养和扩增。 2)骨髓间充质干细胞(BMSC)的原代培养扩增及标记。 3)骨髓间充质干细胞体外诱导分化为平滑肌细胞。 3.组织工程化尿道海绵体的构建及修复兔海绵体尿道缺损。 第一章兔脱细胞尿道海绵体-尿道基质的制备。 实验动物及材料：3月龄雄性新西兰兔，体重2.5～3Kg。Triton-X100、NH3·H2O、恒温摇床等。 研究方法：取健康成年雄性新西兰兔完整尿道及海绵体组织，以Triton-X100与NH3·H2O混合液进行萃取脱细胞处理。标本作病理组织HE染色，观察分析脱细胞效果。 研究结果：制备的CS-UECM质地柔软，镜下可见主要成份是胶原及弹性纤维，且排列规则，未见细胞成份。 研究结论：用Triton-X100+NH3·H2O联合萃取脱细胞可制备兔CS-UECM。 第二章种子细胞的获取、扩增及标记。 1.尿道海绵体平滑肌细胞的原代培养和扩增。 实验动物及材料：2月龄雄性新西兰兔，体重1.5～2Kg。DMEM-HG、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(EDTA)、胎牛血清(FBS)、平滑肌肌动蛋白抗体(SMα-actin)、SABC试剂盒及DAB染色试剂盒。 研究方法：切取新西兰兔阴茎头约1/2，采用组织块法用含10％胎牛血清的高糖DMEM作体外原代培养，并行免疫组化法鉴定。 研究结果：经10～14d培养后，培养瓶底铺满梭状细胞，免疫组化法鉴定确认为兔尿道海绵体平滑肌细胞。 研究结论：采用组织块法能成功培养兔尿道海绵体平滑肌细胞。 2.骨髓间充质干细胞的原代培养扩增及标记。 实验动物及材料：2月龄雄性新西兰兔，体重1.5～2Kg。DMEM-LG、标准胎牛血清、0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)、重组增强型绿色荧光蛋白基因腺相关病毒载体(AAV-EGFP)。 研究方法：采用全骨髓法分离培养BMSC，在此基础上转染AAV-EGFP，观察细胞形态学改变及荧光表达的时间及强度，计算转染效率，确定最佳转染MOI值，MTT法描记细胞生长曲线，观察腺相关病毒载体(AAV)对细胞活性的影响。 研究结果：细胞扩增迅速、形态良好、纯度较高。实验确定AAV转染细胞的最佳MOI值为1×105，以此值转染AAV-EGFP后细胞荧光持续高效稳定表达，可满足示踪标记的需要。AAV转染效率高(＞90％)，对细胞活性无显著影响。 研究结论：采用直接贴壁法培养，可以获得纯度较高的BMSC。转染后BMSC荧光稳定表达，可作为种子细胞良好的示踪标记方法。 3.骨髓间充质干细胞体外诱导分化为平滑肌细胞。 实验动物及材料：2月龄雄性新西兰兔，体重1.5～2Kg。小鼠抗α平滑肌肌动蛋白抗体(SMα-actin)、Cy3-羊抗小鼠IgG、DMEM-LG、Trypsin、胎牛血清。流式细胞仪、超净台等。 研究方法：诱导分化采用共培养诱导和直接诱导两种方法 1).共培养诱导：BMSC用Hoechst33342进行细胞核的标记，接种至六孔板，每孔内加入不同比例(4∶2∶1、1∶1)的兔尿道海绵体平滑肌细胞(CSMC)进行共培养，2天后进行荧光免疫细胞化学测定SMα-actin表达情况。同时设置阴性和阳性对照组。 2).直接诱导：分两组，细胞接种到六孔板后添加含血管内皮生长因子(VEGF)和VEGF加碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)的培养基培养，2天后进行免疫细胞化学检测。同时设阴性对照组以及阳性对照组。 研究结果：对不同组别诱导率方差分析得各组总体均数差异性检验，P＜0.05，表明统计学上有差异。 研究结论：骨髓间充质干细胞可通过添加生长因子(VEGF及b-FGF)和共培养的方法诱导分化为平滑肌细胞，其中以共培养方法效率较高。 第三章组织工程化尿道海绵体的构建及修复兔海绵体尿道缺损。 实验动物及材料：3月龄雄性新西兰兔，体重2.5～3Kg。DMEM-LG、Trypsin、胎牛血清。超净台、显微外科器械等。 研究方法：CS-UECM在含0.1％纤粘连蛋白培养基中培育24h，用酶消化法收集培养扩增的BMSC，并将其浓缩为1×106/cm2的密度，之后在超净台内将细胞悬液接种到CS-UECM的内外表面。将细胞材料复合体置于六孔板内，在37℃的孵箱内进行培育24h，补加培养基。 48只家兔随机分2组：种植BMSC的CS-UECM移植组(A组)，未种植BMSC组的CS-UECM移植组(B组)。A、B组均切除尿道1.5cm后用长1.5cm的CS-UECM修复，术后1，2，4，8，12，24周切取标本进行组织学检查。 研究结果：A组自术后2周开始，组织学见血管和平滑肌逐渐增多；至8、12周时，部分血管内径增宽呈窦样，平滑肌继续增多；24周时，可见和正常尿道海绵体组织类似的组织结构。B组自2周起可见血管，4周起可见平滑肌再生，但血管和平滑肌较少，平滑肌以粘膜下层为多，也无窦样组织形成。 研究结论：应用种植BMSC的兔CS-UECM可修复短段型兔尿道海绵体-尿道缺损，并能再生类似正常尿道海绵体的组织结构。