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机体每天都会遭到来自内源性和外源性的氧化应激诱导的DNA损伤,其损伤机制各不相同。DNA的损伤如果不能及时有效的修复,就会形成突变,进而使细胞处于基因组不稳定状态,甚至引发细胞增殖失控和肿瘤。氧化应激导致的活体细胞内DNA损伤修复,是涉及多种蛋白、多条不同信号通路的复杂进程。修复蛋白的缺失或者突变会使胞内的修复系统不稳定,加大诱发癌症的风险。MAPK级联反应是调节正常细胞增殖、存活和分化的关键信号通路。MAPK级联通路的紊乱常导致人类肿瘤及其它疾病,尤其是MAPK信号通路中的细胞外信号调节激酶(ERK)通路。ERK处于Raf丝氨酸／苏氨酸激酶下游,进化相对保守。Raf先激活MEK,进而使ERK活化,而Raf在癌症中总是呈现一种异常的激活或者突变状态,提示这条信号通路在人类肿瘤发生中的重要意义。此外,Ras小分子GTP酶在人类肿瘤中突变频率是较高的,而Raf-MEK-ERK信号通路又恰恰是其下游作用底物。因此,Ras-Raf-MEK-ERK信号通路网络已被广泛关注,研究者们正企图以此通路为靶点,开发治疗癌症的新药物。JWA是一种广谱的环境应答基因。在前期的研究中,我们已经证实JWA参与氧化应激诱导的DNA损伤修复,通过调控XRCC1, LIG3的表达参与DNA损伤后的BER修复通路；不仅如此JWA还参与VP16和CPT诱导的DNA双链损伤修复。另一方面,JWA通过MAPK信号通路调控不同下游效应分子,影响细胞微丝的重组和细胞迁移,进一步研究还发现JWA能通过整合素信号通路调节小鼠黑色素瘤转移。所以,JWA同时具备参与修复DNA损伤和调控MAPK信号通路功能,而这两方面都在肿瘤的发生发展有着极为重要的意义。因此,本研究中我们将从动物的整体水平来探讨JWA的功能,尤其是对于肿瘤的发生发展是否有影响,并发掘其涉及的确切分子机制。目的：探讨JWA对于皮肤肿瘤发生发展过程的影响,以及其涉及到的分子机制,为了解JWA的功能提供新的科学证据。方法：采用基于Cre-LoxP条件性基因剔除策略构建的条件性JWA基因全身剔除小鼠；用PCR、RT-PCR、基因测序和蛋白质免疫印迹等实验技术分别在DNA.RNA和蛋白水平来鉴定构建的JWA基因剔除小鼠；采用经典的二阶段皮肤瘤诱导实验动物模型,观察药物DMBA/TPA诱导不同基因型小鼠皮肤乳头状瘤的发生发展,评价JWA缺失对于肿瘤形成的影响；使用蛋白质免疫印迹和免疫组化等实验技术检测小鼠的增殖指标PCNA, Ki67;蛋白质免疫印迹技术比较两种基因型小鼠的MAPK信号通路分子表达差异,并分离培养原代的角质形成细胞以验证通路表达；实时定量PCR,蛋白免疫印迹技术探寻JWA通过MAPK通路调控的下游核转录因子；采用中性彗星和免疫荧光实验,在细胞水平验证JWA参与DMBA诱导DNA损伤修复的作用。结果：1.用Cre-LoxP条件性基因剔除策略,成功构建条件性JWA基因全身剔除小鼠,通过小鼠基因组DNA, mRNA和蛋白水平鉴定,确认为JWA外显子2剔除。2.JWA缺失减缓DMBA/TPA诱导小鼠皮肤乳头状瘤的进展。JWA纯合小鼠观察到肿瘤为DMBA用后11周,较野生组小鼠晚2周、生成乳头状瘤的小鼠比例少(P<0.001)、瘤体数量较少(P<0.05)、瘤体直径较短(P<0.01)；免疫组化结果显示DMBA/TPA诱导两组小鼠生成的确为乳头状瘤,而且没有明显的病理学差异。3.JWA缺失抑制了DMBA/TPA诱导的细胞增殖效应。采用多种分子实验技术,检测了两种基因型小鼠乳头状瘤和附近的正常皮肤组织中增殖标记物PCNA和Ki67的表达,无论是mRNA还是蛋白水平,均发现JWA缺失小鼠表达较低。4.JWA缺失阻断TPA介导的MAPK信号通路的磷酸化。提取瘤体和邻近正常组织的蛋白做免疫印迹分析,相对于JWA野生小鼠而言,JWA纯合小鼠中p-MEK和p-ERK水平明显低,MAPK信号通路受到抑制；JNK和P38通路未见明显差异；分离培养的原代角质形成细胞,用TPA处理不同时间亦得到类似结果。5.JWA通过MEK/ERK信号通路调节核转录因子ELKl。提取JWA野生和纯合小鼠的乳头状瘤和邻近正常皮肤组织的mRNA和蛋白,分别做实时定量PCR和蛋白免疫印迹,均发现增殖相关的核转录因子Elkl在JWA野生小鼠较纯合小鼠高;进一步的原代角质形成细胞和胚胎成纤维细胞实验也支持这个结果。6.JWA缺失增加了DMBA诱导的DNA损伤。中性彗星实验和γ-H2AX免疫荧光染色分析发现：JWA缺失后,DMBA诱导角质形成细胞损伤形成的彗星拖尾更长(P<0.01),细胞内的γ-H2AX标记的损伤焦点更多(P<0.05)总而言之,JWA在DMBA/TPA诱导的小鼠皮肤乳头状瘤发生发展过程中起到非常重要的作用。JWA可以通过MAPK信号通路,调节其下游核转录因子Elkl的表达,进而影响细胞的增殖。本研究发现为阐明MAPK信号通路在肿瘤发生发展过程中的作用提供了新的重要科学证据；首次提出JWA作为重要的修复蛋白和MAPK信号通路调节分子在皮肤肿瘤发生发展中的重要作用及其机制。