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猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。近年来,猪瘟的流行特点出现了新的变化,呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存,隐性感染和持续感染并现,给猪瘟的防控带来很大的困难,尽管如此,疫苗接种仍是防控猪瘟最有效的措施。目前,猪瘟弱毒疫苗是猪瘟防治的首选疫苗,但该疫苗免疫后不能对感染与免疫猪进行鉴别诊断。虽然已有通过真核表达系统研制出具有标记功能的E2亚单位疫苗,但低产量、高成本以及生产工艺复杂等缺点限制了其进一步推广应用。因此,开发切实可行的新型疫苗势在必行。GEM颗粒表面展示系统是国外近年来研究的新型外源蛋白展示技术。通过将目的抗原与PA融合表达,将表达后的重组蛋白与GEM进行简单孵育即可实现抗原在GEM颗粒表面的展示,制备出细菌样颗粒疫苗(bacterium-like particle vaccine,BLP)。运用该方法制备抗原既安全高效又价廉快速,国外已有多篇应用该技术开发人类新型疫苗的研究报告。本研究以GEM-PA作为抗原展示平台,成功展示了大肠杆菌表达的E2-PA3融合蛋白,制备出基于猪瘟病毒C-株E2蛋白的BLP疫苗,并初步评价了其免疫效果。此外,本试验还运用大肠杆菌表达系统对EGFP和猪瘟E2纳米抗体进行融合表达,并运用该融合蛋白成功建立了检测CSFV的直接免疫荧光方法。本次研究包括以下三个部分:试验一猪瘟E2蛋白的表达与纯化本试验选取CSFVE2前176aa作为目的基因,将其与PA3融合后在CVC1103宿主菌中诱导表达;SDS-PAGE对重组蛋白分析表明,E2-PA3在大肠杆菌中实现部分可溶性表达;用E2单克隆抗体孵育E2-PA3进行Western blot,可在预计目的蛋白位置产生明显棕色条带;GEM与重组菌破碎上清孵育结果表明,E2-PA3能成功展示在GEM表面并实现浓缩纯化,但还有部分杂蛋白也会被GEM颗粒非特异性吸附。为了消除杂蛋白的干扰,本试验用CVC1105对E2-PA3进行宿主菌优化,试验结果表明,CVC1105重组菌破碎上清与GEM孵育后,E2-PA3蛋白比例明显提高,杂蛋白含量几乎可忽略不计,因此选用CVC1105作为E2-PA3重组蛋白表达菌。试验二BLP疫苗制备及免疫原性鉴定将CVC1105表达的E2-PA3与GEM颗粒进行孵育,得到的BLP抗原与206佐剂等比乳化后免疫小鼠,并设置免疫GEM颗粒和PBS的小鼠作对照组。免疫后抗体检测结果显示,首次免疫3 W后BLP免疫组抗体阻断率达到60%,二免3 W后大约为90%,此后抗体一直维持在较高的水平,而GEM对照组和PBS组阻断率一直维持在20%～30%,明显低于BLP疫苗组(P<0.05);淋巴细胞增值试验结果表明,BLP疫苗组小鼠淋巴细胞刺激系数要明显高于GEM组与PBS组;荧光定量PCR相对定量结果表明,免疫BLP疫苗组IFN-γ及IL-4 mRNA水平要显著高于其他组,即BLP疫苗不仅能诱导高水平的体液免疫,同时也能介导较强烈的细胞免疫。试验三猪瘟荧光抗体的表达及直接免疫荧光方法的建立本试验结合猪瘟E2蛋白纳米抗体特异性结合E2蛋白以及EGFP荧光的特性,将猪瘟纳米抗体VHH与EGFP进行融合后在大肠杆菌中诱导表达,利用镍柱纯化表达蛋白,纯化后的蛋白经定量后孵育CSFV、PRV、PCV-2和PPV感染的PK15细胞以鉴定荧光抗体的特异性,并与传统的CSFV间接免疫荧光试验进行效力比较。结果表明,荧光抗体在大肠杆菌中实现部分可溶性表达,直接免疫荧光试验中只有接种CSFV的PK15细胞组出现明显的绿色荧光,而其他组不出现或只出现少量非特异性荧光。与用商品化单抗建立的间接免疫荧光实验相比,本研究建立的直接免疫荧光方法具有更强的清晰度,且本研究表达的荧光抗体具有生产操作简单、制备周期短和成本低等优点,因此,本试验表达的荧光抗体SE具备运用于CSFV的直接免疫荧光检测的潜在价值。