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缺血性脑卒中是临床常见的一种发病率、致残率、致死率高的急性血管性疾病,严重威胁人类生命健康。目前临床缺血性脑卒中主要治疗手段是再通血管,以保证大脑血液及能量供应,然而脑供血恢复的同时会导致严重的再灌注脑损伤。由于脑缺血再灌注损伤的病生机制并不完全清楚,缺乏有效的临床干预策略,因此深入研究脑缺血再灌注损伤的病生机制,寻找有效的药物干预靶点已成为神经精神药理学、神经病学等研究领域的热点与焦点问题。补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白1（C1q/TNF-related protein 1,CTRP1）具有多种生物功能,参与多种疾病的病理病生过程。CTRP1具有明显的抗凋亡作用;在脑卒中患者血中含量升高,具有减轻OGD/R处理的小胶质细胞炎症和自噬的作用;然而目前尚无CTRP1对神经元作用的相关报道。在本研究中,我们构建体内外实验模型,观察CTRP1对脑缺血再灌注致神经元损伤的作用,并从内质网应激及其蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase,PERK）通路诱导的凋亡角度初步探讨其可能机制,有助于寻找干预脑缺血再灌注损伤的新靶点、开发新型高效的对脑卒中有治疗作用的药物,具有重要的理论价值和临床应用价值。第一部分CTRP1对脑缺血再灌注致大鼠神经元损伤的作用观察目的:观察CTRP1在脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织和血液中的表达变化;通过干预CTRP1的表达,初步观察CTRP1对神经元的作用及机制。方法:1.大鼠中动脉阻塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）致大鼠脑损伤模型建立SD雄性大鼠,腹腔注射4%水合氯醛(400mg·kg-1)麻醉,分离并结扎右侧颈总动脉近心端及颈外动脉远心端,颈内动脉插入线栓,阻断血流1.5h,根据不同实验需求,再灌注时间选择6h、12h、24h、36h、48h、72h。2.不同研究目的的实验设计、动物分组（1）脑缺血再灌注大鼠脑组织和血液CTRP1表达变化检测:假手术组（sham）,脑缺血后再灌注6h组（MCAO/R 6h）、再灌注12h组（MCAO/R12h）、再灌注24h组（MCAO/R 24h）、再灌注36h组（MCAO/R 36h）、再灌注48h组（MCAO/R 48h）、再灌注72h组（MCAO/R 72h）。（2）CTRP1对大鼠缺血再灌注脑损伤的作用观察:假手术组（sham）、模型组（MCAO/R）、模型+空载病毒处理组（MCAO/R+LV-NC）、模型+CTRP1过表达慢病毒处理组（MCAO/R+LV-CTRP1）。（3）CTRP1对脑缺血再灌注大鼠脑组织内质网应激PERK通路的作用观察:假手术组（sham）、模型组（MCAO/R）、模型+空载病毒处理组（MCAO/R+LV-NC）、模型+CTRP1过表达慢病毒处理组（MCAO/R+LV-CTRP1）、模型+CCT020312处理组（MCAO/R+CCT020312）、模型+CTRP1过表达慢病毒+CCT020312处理组（MCAO/R+LV-CTRP1+CCT020312）。CCT020312为选择性PERK激动剂。3.观察指标及检测方法TTC染色观察脑梗死体积;Zea-longa评分评价大鼠神经功能损伤程度;HE染色观察大鼠皮层及海马的病理改变情况;TUNEL试剂盒检测大鼠皮层和海马的细胞凋亡水平;q RT-PCR测定m RNA表达;ELASA测定血中CTRP1含量;免疫荧光双标法检测CTRP1的蛋白表达及定位;免疫共沉淀探索CTRP1与GRP78及PERK之间的内在联系;Western blot测定脑组织内质网应激及凋亡相关蛋白的表达。结果:1.与sham组相比,MCAO/R组大鼠皮层CTRP1m RNA及蛋白表达在再灌注12h及24h明显降低,再灌注24h时CTRP1表达降低最显著,后逐渐恢复至正常水平;与sham组相比,模型组大鼠外周血CTRP1的蛋白含量显著升高,而m RNA表达无显著差别;CTRP1在正常神经元中大量表达,在小胶质细胞中少量表达,在星型胶质细胞中几乎无表达,且与sham组相比,模型组皮层和海马CTRP1的荧光明显减弱。2.与sham组相比,MCAO/R组及MCAO/R+LV-NC组大鼠脑梗死体积明显增大,神经功能评分显著升高,脑组织病理损伤加重,神经元丢失和凋亡明显增加,BAX蛋白表达明显升高,Bcl-2表达明显降低,GRP78、CHOP、PERK、ATF6、ATF4、IRE1a及p-IRE1a等内质网应激相关蛋白表达明显升高。与MCAO/R+LV-NC组相比,MCAO/R+LV-CTRP1组大鼠脑梗死体积及神经功能缺损评分显著降低,脑组织病理损伤明显减轻,神经元丢失及凋亡显著减少;凋亡蛋白BAX的表达显著降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显升高;内质网应激标志性蛋白CHOP、GRP78表达显著降低,PERK通路相关蛋白ATF4表达及p-PERK/PERK比例明显降低,而IRE1通路及ATF6通路相关蛋白ATF6、IRE1a及p-IRE1a的表达无显著变化。3.COIP结果显示CTRP1能与GRP78及PERK结合;与MCAO/R+LV-NC组相比,MCAO/R+LV-CTRP1组大鼠GRP78与PERK的结合强度显著增加,CTRP1与PERK的结合强度增强,而CTRP1与GRP78的结合强度无明显变化。4.相较于MCAO/R+LV-NC组,MCAO/R+LV-CTRP1组大鼠皮层BAX、CHOP、GRP78、ATF4蛋白表达及p-e IF2α/e IF2α、p-PERK/PERK比例明显降低;相比于MCAO/R+LV-CTRP1组,MCAO/R+LV-CTRP1+CCT020312组大鼠脑梗死体积及神经功能评分显著增加,脑组织病理学损伤加重,神经元缺失及凋亡显著增加,BAX、CHOP蛋白表达及p-e IF2α/e IF2α比例明显升高,GRP78、ATF4蛋白表达及p-PERK/PERK的比例变化无统计学差异。结论:1.CTRP1在正常脑组织神经元中广泛表达,在小胶质细胞中较少表达,在星型胶质细胞质几乎无表达。脑缺血再灌注损伤大鼠皮层CTRP1m RNA及蛋白表达明显降低,而外周血CTRP1蛋白含量明显升高,m RNA表达变化不明显。2.CTRP1过表达可减轻脑缺血再灌注大鼠神经元丢失和凋亡,改善大鼠神经功能缺损。此神经保护效应可被PERK通路激动剂部分逆转。3.过表达CTRP1可抑制内质网应激;明显抑制PERK信号通路,但对ATF6及IRE1通路作用不明显;CTRP1可与GRP78和PERK结合,并能抑制GRP78与PERK的解离。第二部分CTRP1对氧糖剥夺/复糖复氧致PC12细胞损伤的作用观察目的:观察CTRP1在氧糖剥夺/复糖复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）处理的PC12细胞中的表达变化;初步观察CTRP1对OGD/R致PC12细胞损伤的作用及机制。方法:1.OGD/R致PC12细胞损伤模型的建立PC12细胞用无糖DMEM培养基在含94%N2、5%CO2及1%O2的三气培养箱培养,1.5h后换为正常培养基,常氧下继续培养。2.不同研究目的的实验设计、细胞分组及处理（1）OGD/R处理的PC12细胞CTRP1的表达变化观察:正常组（Normal）,氧糖剥夺后复糖复氧3h组（OGD/R 3h组）、6h组（OGD/R 6h组）、9h组（OGD/R 9h组）、12h组（OGD/R 12h组）、24h组（OGD/R 24h组）、48h组（OGD/R 48h组）、72h组（OGD/R 72h组）。（2）CTRP1对OGD/R致PC12细胞损伤的作用观察:正常组（Normal）、模型组（OGD/R）、模型+si RNA对照组（OGD/R+si-NC）、模型+CTRP1 si RNA干预组（OGD/R+si-CTRP1）、模型+空载病毒组（OGD/R+LV-NC）、模型+CTRP1过表达病毒组（OGD/R+LV-CTRP1）。（3）CTRP1对OGD/R处理PC12细胞内质网应激的作用观察:正常组（Normal）、模型组（OGD/R）、模型+空载病毒组（OGD/R+LV-NC）、模型+CTRP1过表达病毒组（OGD/R+LV-CTRP1）、模型+空载病毒+衣霉素组（OGD/R+LV-NC+tunicamycin）、模型+CTRP1过表达病毒+衣霉素组（OGD/R+LV-CTRP1+tunicamycin）。衣霉素（tunicamycin）是内质网应激诱导剂。（4）CTRP1对OGD/R处理PC12细胞PERK信号通路的作用观察:正常组（Normal）、模型组（OGD/R）、模型+空载病毒组（OGD/R+LV-NC）、模型+CTRP1过表达病毒组（OGD/R+LV-CTRP1）、模型+CTRP1过表达病毒+CCT020312组（OGD/R+LV-CTRP1+CCT020312）。CCT020312为选择性PERK激动剂。3.观察指标及检测方法MTT法检测细胞活力;流式细胞术及TUNEL染色法观察细胞凋亡水平;q RT-PCR检测CTRP1 m RNA表达;Western blot测定内质网应激相关蛋白表达。结果:1.与正常细胞相比,OGD处理后复糖复氧3h、6h、9h、12h及24h的PC12细胞CTRP1的m RNA表达明显降低,并从12h开始逐渐升高于48h恢复至正常水平;OGD后复糖复氧6h、12h及24h的PC12细胞CTRP1的蛋白表达明显降低,在24h时虽有所上升,但仍然维持在较低水平。2.与Normal组相比,OGD/R组PC12细胞的细胞活力明显降低,凋亡细胞比例增加;与OGD/R组相比,OGD/R+LV-NC组及OGD/R+si-NC组PC12细胞的细胞活力、细胞凋亡等均无显著性变化。与OGD/R+LV-NC组相比,OGD/R+LV-CTRP1组PC12细胞的细胞活力明显升高,凋亡细胞比例显著下降;与OGD/R+si-NC组相比,OGD/R+si-CTRP1组PC12细胞的细胞活力进一步降低,凋亡细胞比例明显上升,细胞损伤进一步加重。3.与Normal组相比,OGD/R组PC12细胞GRP78、ATF4、CHOP、BAX的表达明显升高;相较于OGD/R+LV-NC组,OGD/R+LV-CTRP1组PC12细胞GRP78、ATF4、CHOP及BAX的蛋白表达明显降低;相较于OGD/R+LV-CTRP1组,OGD/R+LV-CTRP1+tunicamycin组PC12细胞的细胞活力明显降低,细胞凋亡水平明显升高,GRP78、BAX、CHOP及ATF4的表达明显增加。4.与Normal组相比,OGD/R组PC12细胞GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP及BAX的表达明显升高;与OGD/R+LV-NC组相比,OGD/R+LV-CTRP1组PC12细胞GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP及BAX的表达明显降低;与OGD/R+LV-CTRP1组相比,OGD/R+LV-CTRP1+CCT020312组PC12细胞的细胞活力明显降低,凋亡细胞明显增多,PERK通路相关蛋白GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP、BAX的表达明显升高。结论:1.OGD/R处理PC12细胞CTRP1m RNA及蛋白表达明显降低。2.CTRP1过表达对OGD/R致PC12细胞损伤有明显保护作用,此效应能被内质网应激诱导剂衣霉素及PERK激动剂CCT020312取消;而RNA干扰CTRP1表达可进一步加重OGD/R致PC12细胞损伤作用。3.CTRP1可能通过抑制PERK信号通路,减轻内质网应激及细胞凋亡,进而改善OGD/R所致PC12细胞损伤。第三部分CTRP1对氧糖剥夺/复糖复氧致原代皮层神经元损伤的作用观察目的:观察OGD/R处理的原代神经元CTRP1表达变化;干预CTRP1表达,观察CTRP1对OGD/R致原代神经元损伤的作用及机制。方法:1.OGD/R致原代神经元损伤模型的建立原代神经元用无糖DMEM培养基在含94%N2、5%CO2及1%O2的三气培养箱培养,0.5h后换为正常培养基,常氧下继续培养。2.不同研究目的的实验设计、神经元分组及处理（1）OGD/R处理的原代神经元CTRP1表达变化观察:正常组（Control）,模型组（OGD/R）。（2）CTRP1对OGD/R致原代神经元损伤的作用观察:正常组（Control）、模型组（OGD/R）、模型+si RNA对照组（OGD/R+si-NC）、模型+CTRP1 si RNA干预组（OGD/R+si-CTRP1）、模型+空载病毒组（OGD/R+LV-NC）、模型+CTRP1过表达病毒组（OGD/R+LV-CTRP1）。（3）CTRP1对OGD/R处理原代神经元PERK信号通路的影响观察:正常组（Control）、模型组（OGD/R）、模型+空载病毒组（OGD/R+LV-NC）、模型+CTRP1过表达病毒组（OGD/R+LV-CTRP1）、模型+CTRP1过表达病毒+CCT020312干预组（OGD/R+LV-CTRP1+CCT020312）。CCT020312为选择性PERK激动剂。3.观察指标及检测方法MTT法检测细胞活力;TUNEL检测神经元凋亡情况;免疫荧光检测神经元纯度;q RT-PCR测定m RNA表达;Western blot测定内质网应激及凋亡相关蛋白表达。结果:1.CTRP1在原代神经元中表达;与Control组相比,OGD/R处理的原代神经元CTRP1蛋白表达显著降低。2.与Control组相比,OGD/R组原代神经元的细胞活力显著降低,凋亡比例显著升高,凋亡相关蛋白及PERK通路相关蛋白表达显著升高;与OGD/R组相比,OGD/R+LV-NC组及OGD/R+si-NC组神经元的细胞活力、细胞凋亡及蛋白表达等均无明显变化;相较于OGD/R+LV-NC组,OGD/R+LV-CTRP1组原代神经元的细胞活力显著增加,神经元凋亡比例明显减少;蛋白Bcl-2的表达水平明显增加,BAX、Cleaved-Caspase3、Caspase12、CHOP、PERK、p-PERK、GRP78、ATF4的表达明显降低,而相较于OGD/R+si-NC组,OGD/R+si-CTRP1组神经元的细胞活力及凋亡比例无统计学差异,Bcl-2的蛋白表达进一步明显降低,BAX、CHOP、Cleaved-Caspase3、CHOP、PERK、p-PERK、GRP78、ATF4的蛋白表达进一步明显升高。3.相比于OGD/R+LV-CTRP1组,OGD/R+LV-CTRP1+CCT020312组神经元的活力明显降低,凋亡反应明显增强,Bcl-2表达减少,BAX、CHOP、Cleaved-Caspase3、Caspase12及CHOP、GRP78、ATF4、p-PERK、PERK的蛋白表达水平明显升高。结论:1.OGD/R处理的原代神经元CTRP1蛋白表达明显降低。2.CTRP1过表达可抑制PERK通路,明显改善OGD/R所致的神经元损伤;而RNA干扰CTRP1表达可进一步加重OGD/R所致的神经元凋亡,激活PERK通路。3.PERK激动剂CCT020312可逆转CTRP1对OGD/R处理原代神经元凋亡及PERK通路的影响,阻断CTRP1对OGD/R致原代神经元损伤的保护作用。4.CTRP1可能通过抑制PERK/ATF4/CHOP信号通路,减轻神经元凋亡,进而对OGD/R所致的神经元损伤产生明显保护作用。