背景组蛋白的翻译后修饰在调控染色质结构和功能中起重要作用。已有研究表明,组蛋白的泛素化和去泛素化在转录调控过程中非常重要,组蛋白H2A的泛素化抑制基因表达,组蛋白H2B的泛素化促进基因表达。USP49是USP家族重要的一员,已有研究报道USP49可以直接结合和去泛素化p53蛋白,调控p53蛋白稳定性,在肿瘤发生发展中起到重要作用。同时,USP49也是组蛋白H2B的特异去泛素化酶,可能通过调节组蛋白H2B泛素化水平调控基因表达。MDM2是P53的一种泛素连接酶,文献报道MDM2组蛋白上富集H2Bub修饰,但是USP49是否可以通过调节H2B的泛素化来调控MDM2的基因表达,进而调控P53及其下游基因目前还没有报道。目的利用CRISPR/Cas9技术敲除USP49基因,构建稳定敲除USP49的HCT116细胞系,研究USP49调控HCT116细胞增殖的作用和分子机制。方法（1）HCT116细胞USP49基因缺陷型细胞系的构建采用CRISPR/Cas9基因编辑技术以及慢病毒转染对HCT116细胞USP49基因进行敲除,挑选单克隆细胞株,利用Sanger测序、RT-qPCR以及Western blot鉴定以验证基因敲除是否成功。（2）USP49缺陷型HCT116细胞的生长和生物学特性研究以HCT116空载单克隆细胞作为对照,对上述构建的USP49缺陷型HCT116细胞进行细胞学特性观察,包括细胞增殖、克隆形成、细胞划痕等。（3）USP49基因敲除对MDM2-P53信号通路的影响通过RT-qPCR实验以β-actin为内参,对USP49敲除细胞系中MDM2、P53、P21、BAX等基因表达水平进行检测。（4）USP49过表达细胞株对HCT116细胞增殖的作用采用USP49过表达载体pc DNA3USP49转染HCT116细胞,过表达细胞系用Western和RT-qPCR验证,对细胞增殖作用用克隆形成验证。（5）USP49对组蛋白H2Bub的影响提取USP49缺陷型细胞和USP49过表达细胞组蛋白,以H3为内参,Western检测目的蛋白H2Bub的变化。（6）USP49对MDM2-P53信号通路基因的H2Bub水平的影响通过染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）,检测MDM2-P53信号通路基因的组蛋白H2Bub水平,从而进一步明确USP49如何在结肠癌发展过程中对MDM2-P53信号通路基因的调控。（7）USP49在结肠癌发展过程中调控的靶基因通过染色质免疫共沉淀实验,利用USP49抗体,检测USP49在结肠癌发展过程中结合的相关基因。结果（1）成功构建HCT116的USP49基因缺陷型细胞系。（2）USP49缺陷型HCT116细胞的生长和生物学特性研究发现,敲除USP49基因后细胞增殖加快,细胞迁移速度加快,克隆形成明显增强。（3）在USP49敲除细胞中,通过RT-qPCR检测发现,在MDM2-P53信号中,MDM2升高、P53降低、P21和BAX降低。（4）在USP49过表达细胞中,USP49的蛋白表达含量和USP49 mRNA水平明显升高,克隆形成能力下降。（5）提取过表达和敲除USP49细胞总组蛋白,Western结果表明,USP49敲除导致组蛋白H2Bub水平升高,而USP49过表达导致H2Bub降低。（6）通过ChIP-qPCR,利用Anti-H2Bub1抗体,检测发现肿瘤相关基因MDM2的H2B的泛素化水平升高,P53,P21和BAX基因泛素化水平降低。（7）利用Anti-USP49抗体,通过ChIP-qPCR实验,检测USP49在肿瘤发生过程中的靶位点,结果表明在USP49过表达细胞中MDM2的启动子区域和5’编码区,USP49结合升高,表明USP49直接结合在MDM2基因位点。结论1.USP49在结肠癌细胞增殖中作为一个抑癌因子调控MDM2-P53信号通路的基因表达。2.USP49作为一个表观修饰酶,结合在MDM2启动子区和编码区,通过调节MDM2基因的H2Bub水平,调控MDM2基因表达,导致MDM2下游P53及其P53下游基因表达发生变化,参与HCT116细胞增殖。