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肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-alphp，TNF-α）是一类具有多种生物学效应的细胞因子。除激活的巨噬细胞外，心肌细胞本身也可分泌产生TNF-α，并参与多种心脏疾病如充血性心力衰竭、心肌炎、缺血性心脏病的病理生理过程。研究证明TNF-α具有抑制心肌收缩的负性肌力作用，其机制可能是抑制收缩期细胞内钙水平的增高。此外，近年来研究发现，TNF-α还具有抑制心肌缺血/再灌注损伤的保护作用，其作用机制可能是通过诱导锰超氧化物歧化酶（manganous superoxide dismutase，Mn-SOD）的表达及活性提高，但是关于TNF-α究竟是通过哪些信号转导通路诱导Mn-SOD表达及活性提高而起到心肌保护作用，尚未见到相关的报道。因此，本文首先在亚细胞水平上研究了TNF-α对心肌细胞舒张期胞内钙重摄取/外排作用的影响，深入探讨了TNF-α的心肌负性肌力作用机制；并且着重分别在器官和细胞水平上，研究了TNF-α心肌缺血保护的机制及其涉及的信号转导途径。 目的 （1） 观察TNF-α对心肌细胞肌浆网Ca2+-ATP酶和肌膜上的Ca2+-ATP酶、Na+/K+-ATP酶活性的影响，以探讨TNF-α的心肌负性肌力作用机制。 （2） 分别在离体心脏和培养的心肌细胞上观察TNF-α在心肌缺血/再灌注或缺氧/复氧损伤中的作用。 浙江大学硕士学位论文 （）研究活性氧、线粒体ATP敏感性钾通道和一氧化氮对TNF－口心肌保护作用的影响，以探讨TNF－口保护作用机制及其下游的信号转导途径。方法 （1）离体大鼠右心室乳头肌的制备及张力的测定：常规右心室乳头肌灌流及张力测定技术。 （2）心室肌细胞酶解分离：I型胶原酶酶解分离心室肌细胞。 （3）细胞内游离钙的测定：用细胞内双波长钙荧光系统（TI．LL，德国）检测细胞内游离钙离子浓度，以Fura－2／AM为钙指示剂。 闪 离体大鼠心室肌细胞肌浆网制备 （5）离体大鼠心室肌细胞膜的制备 （6）肌浆网和肌膜 C。‘”－ATp酶和 N。“从”－ATp酶活性测定：C。‘”．ATp酶和 NS“／K”－ATP酶活性均用无机磷比色法测定。 （7）离体心脏Langendorff灌流及左室功能评价：Langendorff恒压灌流技术。 （8）乳鼠心肌细胞制备和培养 （9）离体心脏缺血－再灌注模型和培养的乳鼠心肌细胞缺氧／复氧模型：离体灌流心脏的缺血模型采用全心停灌方法，以停止灌流20 min，复灌20 min作为缺血／复灌过程。培养的心肌细胞缺氧／复氧模型经缺氧培养12 h后，再常氧培养6 h，作为复氧处理。 （10）心肌损伤和线粒体 Mn－SOD活性指标的分析：利用分光光度法测定冠脉流出液中乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）的活性。提取线粒体以黄瞟吟氧化酶法检测Mn－SOD活性。结果 第一部分：TNF－a对正常大鼠心脏的作用及其可能机制 －2－ 浙江大学硕士学位论文 门)TNF－a抑制大鼠右心室乳头肌的收缩力，20 U／ml和 200 U／ml TNF－a灌流 10 min后，乳头肌收缩力分别减小到对照的91％和兀％0均＜0刀1)八2)TN卜以处理后对心肌细胞钙瞬态变化幅度无明显影响（0．97土0刀5 vs 0．95土0刀7，P＞0刀5）；（3）TNF．a明显抑制肌浆网 Ca’”．ATPase活性，平均抑制率达到 20％；（4）TNF．a桔抗肌浆网 Cd”．ATPase对底物中不同水平的 C／”和 ATP的正相关反应性；（5）hF．a对肌膜 Ca’”－ATP酶和Na”0寸－ATP酶活性无明显抑制作用。 第二部分：TNF－a对缺血／复灌心肌的作用及其可能机制 1、观察hF－a预处理对缺血／再灌注心脏心功能和酶学指标的影响及其可能作用机制 门)与单独缺血再灌注组相比，缺血前 TNF－a （ 0 U／ml）预处理明显减弱缺血再灌注对LV＊P、LV＊＊P、土dP八比nax和LV＊Px＊R的抑制作用（P＜O．05）；（2）TN卜口十缺血再灌注组复灌后，冠脉流出液中LDH含量显著降低；线粒体中Mn－SOD活性明显高于单独缺血再灌注组（P＜0刀5）；（3）分别使用抗氧化剂2－＊＊G（O．3mM）、一氧化氮合酶抑制剂 LNAME（0．5 mM）或 mitoK。，通道抑制剂 5－HD（100 pM）预处理后，减弱了y F－以改善缺血再灌注后心功能的作用；（4）分别使用2－MPG、L－NAME或5羽D预处理后，hF－a抑制缺血再灌注后心肌LDH释放和诱导Mn－SOD活性增高的作用被减弱。 2、研究活性氧和线粒体ATP敏感钾通道是否参与介导TNF－以对缺氧／复氧心肌的保护作用。 （l）用 TNF－a（10～500 U／ml）预处理，缺氧／复氧后。D肌细胞内 Mn－SOD活性增高、LDH释放量减少（P＜0．05）；m抗氧化剂 NAC（lmM）、antimycin A（50 pM）、2－MPG（400 pM）和 Cu／Zn－SOD抑制剂 DDC（100 nM）预处理后，取消了 TNF－a的抑制缺氧／复氧心肌细胞LDH释放和诱导Mn－SOD活性增高的作用；①mitO