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目的：
观察自由基清除剂依达拉奉对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障(BBB)通透性及脑组织基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达的影响,探讨自由基清除剂保护血脑屏障的作用机制。
方法：
1实验分组及动物模型的制备
雄性SD大鼠48只,体重200—250g(河北医科大学试验动物中心提供),月龄2～3个月。随机分为3组,假手术组(S组)、缺血再灌注组(R组)、依达拉奉组(Y组),每组16只。S组:暴露股动静脉,只分离双侧颈总动脉,经枕骨大孔腹侧开颅暴露基底动脉第二无血管区,穿线但不阻断。R组:采用3血管阻断法阻断双侧颈总动脉、基底动脉第二无血管区15 min后再开放。Y组:采用3血管阻断法阻断双侧颈总动脉,基底动脉第二无血管区15 min后开放,同时尾静脉给药。依达拉奉组给予依达拉奉3mg/kg,浓度为1.5mg/ml。假手术组和R组给予生理盐水2ml/kg,三组均再灌注12h。
2标本的采集及检测方法
2.1各组动物脑缺血前5 min(T1)、脑缺血15 man(T2)、再灌注后15 min(T3)分别采集股动脉血监测动脉血氧分压和二氧化碳分压。
2.2大鼠脑组织内MMP-9的浓度的测定
48只雄性SD大鼠于再灌注12h,每组随机抽取8只首先水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,断头处死大鼠,完整取出脑组织,右侧大脑除去额叶皮质其余脑组织制成匀浆,以3500r/min转速离心10min,取上清液液氮罐内保存备用。按照大鼠脑组织匀浆MMP-9酶联免疫试剂盒说明书要求测定各浓度标准品的吸光度,绘制标准曲线,求得回归方程。根据回归方程最后求得每个标本的MMP-9浓度。
2.3电镜观察皮质的病理学改变
取右侧大脑额叶皮质组织,按照“快、小、轻、准”原则在冰盘上切取1mm×1mm×1mm的组织块于4％戊二醛中固定,4℃冰箱中保存1h以上,送电镜室在透射电镜下观察BBB的超微结构的改变。
2.4大鼠脑组织含水量的测定
完整取出脑组织后,去除中脑、脑桥、垂体等留取左侧大脑组织,用滤纸吸干表面水分后置于干燥小瓶中,-20℃冰箱保存备用。用干湿重法(110℃,24h烘干)计算脑组织含水量作为脑水肿程度的判断。计算方法:脑含水量(％)=(湿重一千重)/湿重×100％。
2.5大鼠每克脑组织内伊文思蓝含量的测定
每组其余8只雄性SD大鼠于再灌注12h用10％水合氯醛再次麻醉大鼠,经股静脉注入2％EB生理盐水溶液(4 ml/kg)1h后开胸,通过左心室灌注室温生理盐水(灌注压为110 mmHg),直到右心房流出的液体无色为止断头取脑。去除小脑及脑垂体留取双侧大脑组织剥离干净软脑膜、血凝块,称重,匀浆,放入其4倍体积甲酰胺的离心管中,加上橡皮塞50℃水浴48h,以3000r/min转速离心15min,取上清液待测
结果：
1在脑缺血前5 min(T1)、脑缺血15 min(T2)、再灌注后15 min(T3)血气指标比较差异无统计学意义(P>0.05)
2大鼠脑组织内MMP-9浓度的测定
S组脑组织内MMP-9浓度为(3.98±0.45)％,R组为(7.33±2.46)％,Y组为(5.23±1.67)％。与S组相比,R组脑组织内MMP-9浓度明显增高(P<0.05)；与R组相比,Y组脑组织内MMP-9浓度明显降低(P>0.05)。
3大鼠脑组织含水量的测定
S组脑组织含水量为(75.16±1.78)％,R组为(81.38±1.67)％,H组为(76.55±1.54)％。与S组相比,R组脑组织含水量明显增高(P<0.05)；与R组相比,Y组脑组织含水量明显降低(P>0.05)。
4大鼠每克脑组织内伊文思蓝含量的测定
S组脑组织内伊文思蓝含量为(3.71±0.12)ug/g,R组为(5.00±0.25)ug/g,Y组为(3.93±0.14)ug/g。与S组相比,R组每克脑组织内伊文思蓝含量明显增高(P<0.05)；与R组相比,Y组每克脑组织内伊文思蓝含量明显降低(P>0.05)。
5透射电镜下BBB的超微结构改变
S组:毛细血管外周小部分轻度水肿,腔面微绒毛数量减少,管腔内未见血细胞。线粒体部分嵴和膜融合或消失,粗面内质网轻度脱颗粒,吞饮小泡数量稍微减少。R组:毛细血管周围高度水肿(四面),腔内一个红细胞,微绒毛数量稍微减少。线粒体大部分嵴或部分膜融合或消失,粗面内质网脱颗粒现象严重,吞饮小泡数量减少。Y组:毛细血管腔内有一个红细胞(血红蛋白),微绒毛数量减少,血管周围小部分水肿,小于一面线粒体部分或大部分嵴和膜融合或消失,粗面内质网有脱颗粒现象吞饮小泡和微绒毛数量减少。
通过结果说明:S组损伤最轻,R组损伤最重,Y组介于二者之间,但明显比R组损伤减轻。
结论：
脑缺血后MMP-9表达增高,BBB通透性增加,自由基清除剂依达拉奉可以保护BBB,其作用可能与抑制MMP-9在损伤脑组织中的表达有关。