优质的卵母细胞是成功受精和胚胎发育的先决条件,是生命开始的物质基础。如果卵母细胞没有及时受精,排出的卵母细胞在体内或体外会经历一个时间依赖性的退化过程,称为卵母细胞老化。卵母细胞老化会导致烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）含量下降、DNA损伤增加、线粒体功能障碍和表观遗传修饰改变。表观遗传修饰包括对DNA和相关组蛋白的共价及非共价修饰,可控制基因表达、染色质结构和基因组稳定性。其中,DNA甲基化（5m C）是一种可遗传的表观遗传标记,在哺乳动物早期胚胎发育过程中提供分子记忆并保证转录有序进行,组蛋白修饰影响转录调控因子与染色质的相互作用,在染色质构型重塑和DNA甲基化中发挥关键作用。烟酰胺单核苷酸（NMN）可逆转NAD+不足引起的线粒体稳态失调。研究表明NMN可显著提高老年小鼠NAD+的表达水平,并改善卵母细胞的数量和质量。与其他动物相比,猪卵母细胞的胚胎基因组激活发育阶段更接近人类。而NMN是否能够延缓猪卵母细胞的体外老化,NMN对老化卵母细胞发育而来的早期胚胎是否有改善作用,NMN是否对老化卵母细胞发育而来的胚胎中表观遗传修饰具有影响均未见报道。本试验旨在通过对NMN,猪卵母细胞老化和表观遗传修饰的研究,证明了NMN能够延缓猪卵母细胞的老化,并改善老化猪卵母细胞早期胚胎发育中表观遗传修饰的异常。为解决以上问题,本研究以猪体外培养的卵母细胞和孤雌激活早期胚胎为主要研究对象,检测了NMN对老化猪卵母细胞的影响。首先,通过延长猪卵母细胞在体外的培养时间,构建了体外卵母细胞老化模型,通过免疫荧光染色检测了正常组和老化组中的ROS水平,线粒体含量,线粒体膜电位的水平,qPCR检测了凋亡相关基因BAX和BCL-2的mRNA表达,研究了老化对猪卵母细胞的影响;其次,通过在老化卵母细胞中添加NMN,运用免疫荧光染色分别检测了NMN对老化猪卵母细胞中ROS水平、线粒体膜电位、线粒体含量、细胞膜骨架、染色体/纺锤丝排列和早期凋亡水平的影响,运用qPCR技术进一步检测了NMN对老化卵母细胞中抗凋亡相关基因的表达,探讨了NMN对老化猪卵母细胞的影响。最后,运用孤雌激活的方式对老化卵母细胞进行孤雌激活,运用免疫荧光染色的方法分别检测了NMN对老化猪卵母细胞发育而来的胚胎中DNA甲基化、H3K4me2/3和H3K9me3的影响,qPCR检测了DNA甲基化转移酶和DNA去甲基化转移酶的相关mRNA表达水平,此外,qPCR检测了老化卵母细胞发育而来的胚胎中印记基因IGF2、H19和NNAT的mRNA表达,探究了NMN对老化卵母细胞来源的胚胎中表观遗传修饰的影响。主要结果如下:1.猪卵母细胞老化的生物学变化我们首先延长猪卵母细胞的体外培养时间,构建了卵母细胞老化模型。结果显示,与正常的卵母细胞相比,体外老化24 h,卵母细胞的卵周隙逐渐增大,而在体外老化48 h,卵母细胞胞质的碎裂比例显著增加。免疫荧光染色的结果显示,随着卵母细胞的体外老化,ROS水平呈现出逐渐增加的趋势,而线粒体含量和线粒体膜电位的荧光强度随着老化的延长逐渐降低。qPCR的结果显示,促凋亡基因BAX和抗凋亡基因BCL-2的mRNA表达水平在体外老化24 h无显著性差异,而在体外老化48 h均显著性上升。以上的结果表明,体外卵母细胞的老化会降低卵母细胞的质量。2.NMN对猪卵母细胞老化和早期胚胎发育的影响为研究NMN是否会延缓猪卵母细胞的体外老化,我们通过在老化48 h组中添加不同浓度的NMN。结果显示,100μmol/L的NMN能够显著降低卵母细胞的胞质碎裂比例。免疫荧光染色的结果显示,NMN能够降低老化卵母细胞中高水平的ROS表达水平以及异常的纺锤丝和染色体的比例,改善了老化卵母细胞中线粒体含量、细胞膜骨架以及早期胚胎发育的能力。qPCR的结果显示,NMN增强了老化猪卵母细胞中抗氧化基因的mRNA表达水平,并改善了老化胚胎中多能性基因的表达。以上的结果表明,NMN能够延缓猪卵母细胞的老化,并改善老化猪卵母细胞的早期胚胎发育能力。3.NMN对老化胚胎表观遗传修饰的影响为了进一步检测NMN是如何改善老化卵母细胞的早期胚胎发育能力,我们对老化卵母细胞发育而来的胚胎（以下称为老化胚胎）进行了表观遗传修饰的检测。免疫荧光染色的结果显示,NMN能够显著增强老化胚胎中5hm C、H3K4me3的修饰水平,而显著下调H3K4me2和H3K9me3的修饰水平,qPCR的结果显示,NMN能够改善老化胚胎中印记基因NNAT和DNA去甲基化转移酶的相关mRNA的表达。以上的结果表明,NMN通过修复老化胚胎中异常的DNA甲基化和组蛋白甲基化修饰水平进而改善老化卵母细胞的早期胚胎发育能力。