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犬新孢子虫（Neospora caninum）,简称新孢子虫（Neospora）,新孢子虫是一种寄生于细胞内的原虫,引起中间宿主如牛、羊的生殖障碍等,导致新孢子虫病。该病呈全球性流行,对牛养殖业造成极大的经济损失。然而目前市面上还没有预防和治疗新孢子虫病的特效药,妥曲珠利及其衍生物帕托珠利对治疗新孢子虫病有较好效果。虽然疫苗是预防病原感染的有效手段,但目前也没有出现成熟有效的商品化新孢子虫病疫苗。人们对宿主与新孢子虫感染之间的免疫机制还缺乏深入了解。作为一种程序性细胞死亡,Gasdermin-D（GSDMD）介导细胞焦亡在清除胞内病原中发挥重要作用。本实验室前期研究发现在新孢子虫感染中宿主NLRP3炎症小体可介导细胞焦亡,发挥抗新孢子虫感染的作用;牛巨噬细胞发生焦亡后,胞内新孢子虫数量减少。但新孢子虫感染中GSDMD介导细胞焦亡的信号通路、其抑制虫体增殖的机制及细胞焦亡是否可作为筛选治疗药物的潜在靶标尚需阐明,以期为新孢子虫的治疗提供新思路。主要研究内容有:GSDMD介导细胞焦亡在新孢子虫感染中的信号转导通路。利用Western Blot等方法探究GSDMD介导细胞焦亡在新孢子虫感染中的信号转导通路,具体如下:（1）新孢子虫诱导GSDMD介导细胞焦亡情况。分别建立新孢子虫感染小鼠腹腔、骨髓源巨噬细胞细胞模型,检测细胞焦亡发生情况,并选择最适巨噬细胞用于后续试验。结果发现新孢子虫均可诱导两种细胞发生GSDMD切割和caspase-1活化,导致细胞焦亡,且腹腔巨噬细胞的焦亡激活更明显。（2）新孢子虫诱导细胞焦亡的信号转导通路。利用新孢子虫感染野生型（WT）、GSDMD-/-、NLRP3-/-、ASC-/-和caspase-1/11-/-巨噬细胞,检测焦亡通路中caspase-1、GSDMD及IL-1β等变化情况。结果发现NLRP3可影响GSDMD表达,但LDH结果显示NLRP3、ASC和caspase-1/11不影响新孢子虫诱导的细胞死亡。与WT组相比,缺失GSDMD后,新孢子虫诱导的IL-1β和caspase-1分泌并未减少;LDH显示细胞死亡减少约9%,但差异不显著;caspase-8活化更明显;提示在新孢子虫感染中GSDMD表达受NLRP3影响,但不负责IL-1β和caspase-1的释放,除了发生GSDMD介导细胞焦亡外还存在其它形式细胞死亡。（3）新孢子虫诱导小鼠体内的细胞焦亡。通过新孢子虫感染小鼠的动物试验检测小鼠体内是否发生细胞焦亡。结果发现在腹腔灌洗液细胞中不仅可检测到caspase-1活化和GSDMD切割,同时还检测到了坏死性凋亡执行蛋白MLKL的磷酸化,说明新孢子虫感染可同时引起细胞焦亡和坏死性凋亡两种细胞死亡,为下一步深入研究细胞焦亡抗新孢子虫的作用提供依据。GSDMD介导细胞焦亡抑制新孢子虫增殖的研究。通过q PCR等方法检测GSDMD介导的细胞焦亡对新孢子虫增殖的影响,具体如下:（1）GSDMD对新孢子虫增殖的影响。用新孢子虫同时感染WT和GSDMD-/-腹腔巨噬细胞,检测细胞内虫体数量。结果发现与WT组相比,GSDMD-/-细胞中的虫体数量明显增高,细胞感染率未发生改变,但纳虫空泡中速殖子数量显著增多。（2）细胞焦亡产物对新孢子虫产生的影响。用LPS和ATP共同分别刺激WT和GSDMD-/-腹腔巨噬细胞,用两种焦亡产物孵育后的新孢子虫再感染WT型巨噬细胞后,观察胞内虫体数量。结果发现相比较于WT组焦亡上清孵育后的新孢子虫,缺失GSDMD的焦亡上清使虫体对细胞的感染率显著升高,纳虫空泡内速殖子数量明显增多,多为8个及以上。说明发生GSDMD介导细胞焦亡会抑制胞内虫体增殖,焦亡后的产物可降低新孢子虫再感染细胞的能力。细胞焦亡通路激动剂对新孢子虫增殖的作用研究。通过q PCR和电镜观察等方法探索细胞焦亡通路激动剂对新孢子虫增殖的影响,具体如下:（1）细胞焦亡激动剂的初步筛选。建立新孢子虫感染小鼠模型,选用三种能激活细胞焦亡的激动剂氯硝柳胺、伊维菌素和小檗碱治疗新孢子虫感染的小鼠。以妥曲珠利作为阳性对照,通过生存率等筛选出具有抗新孢子虫潜力的焦亡激动剂。结果发现氯硝柳胺和伊维菌素可提高小鼠的生存率,具有一定治疗效果。（2）细胞焦亡激动剂抗新孢子虫感染小鼠的效果评价。设置氯硝柳胺和伊维菌素不同浓度梯度,处理新孢子虫感染小鼠,通过统计小鼠生存率等进一步评价这两种激动剂药物的治疗效果。结果发现伊维菌素0.5mg/kg为所选的最佳浓度,小鼠存活率约为50%,效果优于氯硝硫胺。（3）伊维菌素对新孢子虫诱导细胞焦亡的影响。用伊维菌素处理新孢子虫感染的细胞后检测IL-1β释放,探究伊维菌素是否促进新孢子虫诱导的细胞焦亡。结果发现伊维菌素可显著提高新孢子虫诱导的IL-1β释放,促进细胞焦亡的发生。（4）伊维菌素体外抗新孢子虫的效果评价。用伊维菌素分别处理新孢子虫感染的VERO细胞和新孢子虫,评价其对胞内虫体增殖和虫体的影响。结果发现伊维菌素可使细胞内虫体数量、细胞感染率和纳虫空泡中速殖子数量均明显减少,且抑虫效果优于阳性对照妥曲珠利。透射电镜观察结果显示伊维菌素可使虫体边缘变形,膜破裂等,直接破坏正常形态结构。说明筛选出的细胞焦亡激动剂伊维菌素可显著抑制新孢子虫增殖,对新孢子虫感染具有一定治疗作用。综上,本研究发现新孢子虫可以诱导小鼠体内及小鼠巨噬细胞发生GSDMD介导的细胞焦亡,NLRP3影响GSDMD的表达;GSDMD介导细胞焦亡会抑制胞内虫体增殖,焦亡产物可降低新孢子虫对细胞的再感染能力。伊维菌素作为一种细胞焦亡激动剂可促进新孢子虫诱导的炎症小体-细胞焦亡反应,显著抑制细胞内新孢子虫增殖,并且对虫体具有直接损伤作用,对新孢子虫感染的小鼠也具有一定的治疗作用。本研究表明细胞焦亡通路可作为筛选治疗新孢子虫病药物的潜在靶标。