第一部分理论探讨一、应激与抑郁症的关系应激（stress）是Han Salye于20世纪30年代提出的一种在外环境剧变的刺激时，机体出现的综合应答状态，包括精神、神经、内分泌和免疫等方面的反应。当机体感受应激源时，下丘脑-垂体-肾上腺轴（hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）兴奋性提高，肾上腺分泌应激激素糖皮质类固醇（glucocorticoids，GC）升高，从而动员储能，提高心血管张力，同时血中葡萄糖水平提高，免疫功能受抑制；适当应激反应有利于机体度过短期恶劣环境，保存生命，但若机体长期处于应激状态，HPA轴功能持续亢进，使机体长期处于高水平的GC中，即使是生理性的应激反应对机体也将十分不利。研究表明，长期强烈身心应激严重影响着人类的身心健康，使机体出现抑郁症等多系统疾患，而这些疾患的严重程度无一不是与HPA轴持续亢进、血中GC水平升高密切相关。慢性应激可以诱导抑郁症已成为公认事实，有抑郁症史的自杀病人的行为表现与慢性应激引发症状非常一致。抑郁症病人表现出神经精神缺陷的机制不明，研究发现，抑郁症病人不仅有情绪紊乱，而且有神经精神系统损伤。李云峰等就慢性应激与抑郁症之间的关系提出了如下假设：慢性应激→血中GC水平持续提高→海马等脑区GC受体失敏，盐皮质激素受体（mineralocorticoid reccptors）MR／糖皮质激素受体（glucocorticoidreccprors）GR比例异常→HPA轴功能亢进→高皮质酮血症→缝核-海马系统5-HT等单胺系统传导功能低下、兴奋性氨基酸（EAAs）释放→受体后信号转导系统异常(包括Ca²⁺失衡)→神经生长因子（neurotrophic growth factor，NGF）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）等神经营养因子mRNA表达降低→海马神经元受损→抑郁症。二、抑郁症的发病机制（一）传统的单胺神经递质假说“单胺假说”由最初的药理学发现发展而来，由于利血平能耗竭中枢儿茶酚胺而导致易患个体抑郁症发作，单胺氧化酶（monoamine oxydise，MAO）为生物胺代谢中的重要酶，单胺氧化酶抑制剂（monoamine oxydise inhibitors，MAOIs）有抗抑郁作用，与其能阻止单胺递质的代谢而增加单胺递质的含量有关，三环类抗抑郁剂（tricyclicantidepressants，TCAs）能阻止突触前膜对单胺递质的吸收而增加单胺递质的利用。由此，单胺递质假说认为，抑郁症的生物学基础是中枢神经系统突触间隙单胺类神经递质水平或功能下降，药理学的研究也显示，提高中枢神经系统胺类神经递质功能或提高它们在突触间隙的浓度的药物都有改善情绪或治疗抑郁症状的作用。单胺类递质主要包括儿茶酚胺（catecholamine，CA）、5-HT和组胺（HC）。其中儿茶酚胺类递质主要包括NE、DA和肾上腺素（epinephrine，E），其合成过程是以酪氨酸(tyrosinel作为底物，经过酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）羟化，多巴脱羧酶（DOPA decarboxylase，DDC）脱羧生成，多巴胺经多巴胺-β-羟化酶羟化生成去甲肾上腺素，去甲肾上腺素经苯乙醇胺氮位甲基移位酶催化获得甲基，生成肾上腺素。目前发现主要是5-HT、DA、E、NE与抑郁症的发病关系较为密切。5-羟色胺（serotonin，5-HT）与抑郁症：机体内5-HT有99％存在于外周，有1％存在于中枢神经细胞内。与抑郁症相关的是中枢5-HT系统含量减少。血中色氨酸通过血脑屏障进入脑后，首先在色氨酸羟化酶作用下生成5-羟色氨酸，然后在5-羟色氨酸脱羧酶的作用下脱羧生成5-HT。5-HT被释放到突触间隙后，大部分被神经末梢重摄取，被重摄取后其中一部分重新进入突触小泡内贮存，另一部分是在线粒体单胺氧化酶的作用下，首先脱氨基生成醛，再经醛脱氢酶的作用氧化成5-羟吲哚乙酸，这是5-HT代谢的主要方式。5-HT在脑内灭活的主要方式为5-HT神经元对游离5-HT的摄取。5-HT功能活动降低与抑郁症患者的抑郁心境、食欲减退、失眠、昼夜节律紊乱、性功能障碍、焦虑不安、不能应付应激、活动减少等密切相关。部分三环类抗抑郁药、5-HT重摄取抑制剂可阻碍5-HT的回收，有抗抑郁作用；而5-HT的前体色氨酸、5-羟色氨酸也可增加突触间隙的5-HT含量，有治疗抑郁症的作用；选择性5-HT耗竭剂可逆转三环类和单胺氧化酶抑制剂的抗抑郁效应；利血平可耗竭5-HT，导致抑郁。去甲肾上腺素（noradrenaline，NE）与抑郁症：有学者认为，NE缺乏可导致抑郁症的发生，尤其是从脑干的蓝斑色素上皮向边缘系统的投射通路中的NE匮乏。这一假说得到了许多实验的证实，如在抑郁症患者的尿与脑脊液中，NE的代谢产物明显减少。尸检研究发现在抑郁症自杀者的皮层中NE受体的密度明显增加。而当突触的NE释放降低时会使突触后受体上调以发挥代偿作用，因此受体密度的增高反映了NE水平的降低。药理学的研究表明NE再摄取抑制剂可以改善许多病人的抑郁症状，更加说明NE可能参与了抑郁症的形成。NE不足的患者通常难以将注意力集中在目标行为上，并且伴有工作记忆障碍、信息加工过程缓慢、抑郁的情感、注意障碍、精神运动迟滞、疲乏等表现。多巴胺（dophamine，DA）与抑郁症：抑郁症患者脑内DA的代谢与抑郁症有关。一些实验结果显示在抑郁症患者的脑脊液中DA代谢产物的含量减少，另外一些实验的结果却显示出DA代谢产物的含量没有变化或增高，因此DA与抑郁症的关系尚无定论。（二）抑郁症的海马神经元损伤1．长期慢性应激刺激能够持续激活HPA轴，导致GC水平升高。海马是调节HPA轴的高位中枢，且富含糖皮质激素受体（Glucorticoid receptor，GR），因此极易受到过量GC攻击而受损。正常情况下，海马对HPA轴具有抑制作用，海马受损后这种抑制作用明显减弱，进一步加重HPA轴的亢进。抑郁症时过量的GC会使谷氨酸（glutamate，Glu）释放增加，并抑制Glu在突触间隙内被重摄取，从而引起Glu在细胞外大量聚积。Glu是中枢内主要的兴奋性神经递质。海马内，无论是传入、传出或是中间神经元，绝大多数都属Glu能神经元，而海马CA₃区神经元则全部为Glu能神经元，适量的Glu可介导神经元之间的兴奋传递而维持大脑正常的兴奋性，但过量Glu会对海马产生神经毒性作用。突触间Glu的大量聚积，会激活神经细胞膜上N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体通道，使Ca²⁺通道开放，Ca²⁺大量内流，造成胞内Ca²⁺超载，与钙调蛋白结合于一氧化氮合酶相应位点，催化一氧化氮（NO）生成。NO是一种自由基，它与超氧自由基产生过氧化酸根（ONOO-），ONOO-损伤线粒体，导致神经元变性、死亡，而且ONOO-能与氢离子形成ONOOH，ONOOH很快分解生成亚硝酸根，亚硝酸根和过氧化亚硝酸根都是损伤性的自由基：ONOO^-又易和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）反应生成一个很强的亚硝基化剂，能使SOD活性中心上的酪氨酸发生亚硝化反应，从而影响SOD的催化功能。此外，由于NO带有额外电子，还可与过氧化氢酶（catalase，CAT）活性中心的铁离子发生反应而抑制了过氧化氢酶的活性。CAT及SOD在体内能消除有害的过氧化物，这样，NO对机体的毒性作用就愈加明显。同时大量NO可进一步增高GC。这样，NO既可通过自身引起的毒性损害海马，又可加重GC对海马的损害。2．BDNF的下调可导致海马神经元的萎缩甚至死亡，这在应激相关的心理疾病中起重要作用。BDNF是5-HT能神经元的生长因子，大鼠中脑慢性注射BDNF可增加5-羟色胺更新率和去甲肾上腺素水平；在成年大鼠新皮质注射脑源性神经营养因子甚至可以产生新的茂盛的5-HT神经末梢。BDNF对5-HT神经元生长和再生的作用提示了神经营养因子与抑郁症之间的关系。在大鼠中缝背核注射BDNF可改善不可逃避电击引起的获得性无助和强迫游泳引起的抑郁。抑郁症患者或创伤后应激失调患者海马体积明显缩小，表明BDNF在抑郁症中的作用已于基础和临床研究中被证实。多种抗抑郁药如单胺氧化酶抑制剂、单胺回收抑制剂可增加脑内BDNF mRNA的表达，上调内源性BDNF水平、逆转海马神经元的萎缩。急慢性电休克治疗的抗抑郁作用至少部分依赖脑源性神经营养因子的上调。三、抗抑郁剂的作用机制目前，临床上广泛使用的抗抑郁剂主要是基于提高中枢单胺抵制含量策略研发的，主要可以分为以下四类：（一） MAOIs：属于第一代抗抑郁药。作用机理是使脑内神经细胞MAO的活性降低，使单胺类神经递质降解减少，从而提高NE、5-HT、DA的含量而起到抗抑郁的作用。（二） TCAs：是第二代抗抑郁药。属于第一代单胺再摄取抑制剂，作用机理是抑制突触前膜对NE、5-HT的再摄取，提高突触间隙NE、5-HT的含量，从而起到抗抑郁的作用，而且还有抗胆碱的作用。（三）选择性NE重摄取抑制剂：属于第三代抗抑郁剂。作用机理是抑制突触前膜对NE的再摄取，但不影响5-HT的再摄取。（四）选择性5-HT重摄取抑制剂（selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs）：属于第四代抗抑郁剂。可选择性的抑制突触前膜对5-HT的重摄取，对E、DA、HT及胆碱能神经影响较小。具有与TACs类似的作用。（五） SNRI（5—羟色胺和NE再摄取抑制剂）和NaSSA（去甲肾上腺素能和5—羟色胺能抗抑郁剂）：属于第五代抗抑郁剂。作用机理是能阻断NE能神经元突触前膜α_2^-受体，阻断负反馈，促进神经元释放NE，还可以阻断5-HT神经元突触后膜α_2^-受体，促进5-HT的释放。四、抑郁症从肝论治的中医理论分析虽然中医学没有“抑郁症”这一病名，但“郁症”、“百合病”等病症实际上属于抑郁症范畴。对郁证早在《内经》时代便有较系统的研究，其中情志内郁致病的思想对后世影响深远。汉代张仲景进一步提出情志之郁以肝郁为主，并创立了治疗肝郁的方药。肝郁多由长期情志不畅所致。临床表现以精神抑郁、萎靡不振、胸闷胁胀、不思饮食、失眠多梦、多疑善虑、悲伤欲哭、善长太息为主症，与现代医学抑郁症的临床表现基本相符。这是因为郁怒不畅使肝失条达，气失疏泄，而致肝气郁结。从中医临床辨证分型也能看出肝郁是造成郁证的核心，同时涉及影响多个脏腑，出现脾虚、肾虚、气郁化火、郁久伤阴、阴虚火旺等多种证型。治疗虽有健脾、补肾、清火、化瘀、安神等方法。但调肝解郁是必不可少的重要环节。由此可见抑郁症与肝关系甚为密切，从调肝的角度治疗抑郁症具有一定的理论基础。关于抑郁症与中医肝的相关性研究可见大量报道。第二部分实验研究第一节加味四逆散（JWSNS）抗抑郁作用的药效学研究采用悬尾方法观察JWSNS的抗抑郁效应。SPF级KM小鼠，雄性，体重17—22g。广州中医药大学实验动物中心提供。自由摄食、饮水，在光暗周期为12h，室温为20-23℃的安静环境适应一周后，小鼠悬尾实验1：将小鼠按体重随机分为5组，按以下方法连续给药7d。（1）正常对照组：每天定时灌服生理盐水0.8ml；（2）中药低剂量组：每天定时灌服0.294g／ml生药0.8ml：（3）中药中剂量组：每天定时灌服0.588g／ml生药0.8ml；（4）中药高剂量组：每天定时灌服1.176g／ml生药0.8ml；（5）氟西汀组：每天定时灌服生理盐水0.8ml，悬尾实验前30分钟以10mg／kg的量腹腔注射百优解溶液。第（1）、（2）、（3）、（4）组给药后1h，第（5）组给药后30分钟，进行小鼠悬尾实验。距小鼠尾尖部约1cm处用医用胶布贴于悬尾箱的支架上，小鼠头部距离箱底约40cm。悬挂时间为6min，用秒表记录后5min的不动时间。不动的标准是小鼠停止挣扎，完全不动。小鼠悬尾实验2：方法同实验1，给药时间延长至14d。小鼠悬尾实验3：方法同实验1，给药时间延长至21d。药物JWSNS组成：柴胡5g、白芍15g、枳壳6g、枸杞子15g、山栀5g、干地黄18g、石决明30g。药材由本校第一附属医院药房提供，经药剂科鉴定均为纯正药材。将中药制成粗粉，首煎将中药粗粉置8倍温水中浸泡0.5h，沸腾后文火煎煮4h，注意均匀搅拌，取汁后经三层纱布过滤；第二次和第三次煎煮均分别以6倍水文火煎煮2h，同样方法取汁，合并三次药液，常规煎煮取汁后浓缩至含生药0.294g／ml、0.588g／ml、1.176g／ml（即用药剂量为成人70kg体重剂量的1、2、4倍），药液常温冷却后，置4℃冰箱内保存备用。所有数据均以（?）±s表示，采用SPSS11.0统计软件包进行统计分析灌胃JWSNS 7d后，JWSNS低、中、高剂量组与正常对照组比较均无统计学差异，氟西汀组与正常对照组有统计学差异（P＜0.05）；灌胃JWSNS 14d后，JWSNS低、中、高剂量组与正常对照组比较均无统计学差异，氟西汀组与正常对照组有统计学差异（P＜0.05），灌胃JWSNS 21d后，JWSNS高剂量组与正常对照组比较无统计学差异，JWSNS低、中剂量组与正常对照组比较有统计学差异，氟西汀组与正常对照组有统计学差异（P＜0.05）。说明JWSNS低中剂量有确切的抗抑郁作用。但同时也说明，中药JWSNS的作用时间较长，要连续21天给药方可取效，这说明复方中的抗抑郁活性成分需较长时间才能达到最稳定的血药浓度，发挥疗效，由此可见，进行中药复方成分的优化筛选是我们今后工作的方向。第二节调肝方药加味四逆散对慢性轻度不可预见性应激模型体重和糖水消耗的影响采用Willner P慢性轻度不可预见性应激动物模型，并加以改进。SD大鼠，雄性，体重160-200g广州中医药大学实验动物中心提供。购进后，自由进水进食，在明暗周期为12小时，温度为23±2℃的安静环境饲养一周，进行3天双瓶训练，然按照体重和基础糖水消耗分为3组：正常组（不施加任何刺激），慢性轻度不可预见性应激组，加味四逆散组（每次早上8：30灌胃中药JWSNS，每次2ml），慢性应激组每次灌胃等量蒸馏水。正常组与其余各组分房饲养。慢性轻度不可预见性应激模型的复制：正常组与造模组大鼠分房饲养。接受应激处理的组别大鼠单独放在一间独立的房间，在21天接受不同应激源的刺激，应激源包括有限制空间1h、45度斜笼7h、湿笼17h（湿笼是300g铺料倒100ml水，使垫料湿透）、新入侵者（两笼并笼）23h、禁食禁水23h。大鼠按体重和基础糖水消耗分为3组：正常组（不施加任何刺激），慢性轻度不可预见性应激组，加味四逆散组加味四逆散组，慢性应激组每次灌胃等量蒸馏水。正常组与其余各组分房饲养。经过禁食禁水23小时后，于造模的第7、14、21天进行糖水消耗，并测量体重。糖水消耗实验：用纯水将蔗糖配制成浓度为1％的蔗糖水，于造模后的第一、二、三周上午8：30，将标号、称重过的盛有纯水和蔗糖水的饮水瓶（200ml），分别插入鼠笼笼盖左右两端（蔗糖水在左，纯水在右）1h，1h后将饮水瓶取下，称重。计算大鼠的糖水偏爱度。糖水偏爱度=[1h蔗糖水饮用量／（1h蔗糖水饮用量＋1h纯水饮用量）]×100％。造模期间各组大鼠一般状况观察。统计学处理，同第一节二、结果造模第一周，中药组大鼠一直对灌胃表现比较抗拒，前三天中药组有大便溏臭的状况，从第四天起逐渐好转并消失。精神状态尚可，存在修饰行为。进入造模第二周，中药组大鼠对灌胃抗拒现象逐渐减轻，模型组毛色比较晦暗，修饰行为减少，但中药组和模型组在精神状态上无明显差别。进入造模的第三周，模型组大鼠整体状况较前两周明显下降，表现在状态，毛色，体重及糖水消耗上；修饰行为基本消失。中药组整体状态要优于模型组。在造模前，各组大鼠的体重无差别（P＞0.05）；经过7天慢性轻度不可预见性应激造模后，模型组、药物组大鼠体重显著低于正常组，差别有统计学意义（P＜0.01），且模型组、药物组间无显著差异；经过造模14天后，模型组、药物组大鼠体重显著低于正常组，差别有统计学意义（P＜0.01），且模型组、药物组间有差异（P＜0.05）；经过造模21天后，模型组、药物组大鼠体重显著低于正常组，差别有统计学意义（P＜0.01），且模型组、药物组间有显著差异（P＜0.01）。在造模前各组大鼠的糖水偏爱无差别，经过21天慢性轻度不可预见性应激造模后，模型组的糖水偏爱度明显低于正常组（P＜0.01），表明CUMS能引起大鼠糖水偏爱度下降。而JWSNS能够逆转CUMS抑郁大鼠糖水偏爱度的下降。采用双瓶实验来衡量液体消耗实验中的各项指标，结果表明CUMS过程中1％的蔗糖水消耗量和1％糖水偏爱百分比从造模后的第二周起显著下降，并在整个造模过程中均处于较低水平，JWSNS治疗后1％的糖水偏爱度显著提高。表明JWSNS能够使CUMS大鼠的1％糖水偏爱度升高。因此，我们认为JWSNS具有抗应激性抑郁的效应。值得注意的是，第一周造模结束后，正常组，模型组与JWSNS组之间的糖水消耗值很接近，差异无统计学意义，分析其原因，可能是因为被移入另外房间，正常组大鼠在短时间内还不太适应；由于我们采用的CUMS模型是一种慢性的不可预见性的温和刺激，造模力度相对不是很剧烈，所以在造模开始的一周内，模型的效果还不是很明显；而JWSNS组大鼠，由于对灌胃给药的适应性问题及抗抑郁剂的起效时间延迟等因素，在造模开始的一周内还未见明显效果。模型组大鼠的体重下降可能是由于长期慢性应激引起的促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin-releasing hormone，CRH）释放增多，抑制了其摄食中枢，使其食欲下降，摄食减少。我们以往的研究也证实了JWSNS可以减少由慢性应激所导致的CRH过量释放，所以JWSNS组大鼠的体重与正常组无明显差异。体重是当机体处于应激状态下，衡量个体状态的非特异性指标。第三节JWSNS对慢性轻度不可预见性应激模型大鼠中枢单胺神经递质含量的影响采用SPF级Wistar大鼠，雄性，体重180-220g，广州中医药大学实验动物中心提供。药物和给药方法基本与第二节相同。造模方法，同第二节；大鼠中枢单胺神经递质检测采用高效液相色谱方法。经过21天慢性应激后，模型组大鼠中枢5-HT、NE、DA含量与正常对照组相比显著减低，且差异具有统计学意义（P＜0.01）；JWSNS组中枢NE含量较模型组相比显著升高（P＜0.05）、DA含量与模型相比组显著升高（P＜0.01），5-HT含量与模型组相比也有升高，但差异无统计学意义。本实验结果表明：CUMS可以引起大鼠中枢单胺递质（包括5-HT、DA、NE）含量的显著降低，（P＜0.01）：JWSNS能够升高CUMS模型大鼠5-HT、DA、NE含量。由此推断上调中枢部分单胺神经递质含量是调肝方药JWSNS抗应激性抑郁症的机制之一，但具体的作用途径与靶点还有待进一步研究。第四节JWSNS对慢性不可预见性应激模型大鼠海马神经元凋亡率的影响动物分组及药物和给药方法基本与第二节相同，造模方法与第二节相同。海马神经元凋亡率采用流氏细胞仪检测分析。模型组大鼠海马神经元大量海马神经元凋亡：正常组与JWSNS组含亚G₁期细胞百分比较小，表明有少量凋亡细胞存在：与正常组相比，模型组细胞凋亡率明显增加（P＜0.01），与模型组相比，JWSNS组海马神经细胞凋亡率明显下降，提示21天的慢性轻度不可预见性应激模型可引起海马神经元的凋亡，而JWSNS有明显降低海马神经元凋亡率，保护海马神经元的作用。海马神经元损伤近年来被作为应激性抑郁症发病的新机制，本研究发现CUMS模型大鼠海马神经元凋亡率明显升高，这表明海马神经元凋亡是应激性抑郁症的病理基础之一，而JWSNS能明显降低海马神经元凋亡率，具有海马神经元保护作用。基于保护海马神经元的抗抑郁剂开发策略已成为抗抑郁及研发的热点，我们的实验研究结果证实中药复方JWSNS可通过此作用机制发挥抗抑郁效应，但其具体作用环节及作用靶点有待于进一步研究。第三部分研究结论一、JWSNS能够显著提高大鼠因CUMS引起的糖水偏爱度的下降，表明JWSNS具有抗抑郁作用。二、JWSNS能显著提高CUMS模型大鼠中枢DA、NE的含量，5-HT的含量也有所提高，但与正常组相比，差异无统计学意义。因此，JWSNS可能通过上调部分中枢单胺神经递质含量发挥抗抑郁效应。三、JWSNS能够降低CUMS引起的大鼠海马神经元凋亡率的升高，具有海马神经元保护作用，这也可能是其抗抑郁作用机制之一。