目的血浆苏氨酸、半胱氨酸和胡椒酰胺作为非小细胞肺癌（NSCLC）诊断生物标志物的价值很少被探索。大多数以前的代谢组学研究都缺乏包含混杂因素的验证集。本研究的目的是利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）探索和验证血浆氨基酸和胡椒酰胺作为NSCLC诊断标志物的价值。方法本研究共纳入250名参与者,其中167名病理证实为NSCLC患者和83名健康对照（HCs）。这些参与者按时间顺序和一定比例分为训练集、验证集1和验证集2。通过LC-MS/MS测量这些治疗前NSCLC患者和健康对照者血浆中22种氨基酸和1种胡椒酰胺的水平。在多变量分析、单变量分析、接受者操作特征（ROC）分析后确定代谢生物标志物。此外,对这些生物标志物和转录组数据进行联合通路分析。结果整合数据集中苏氨酸、胡椒酰胺、精氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和组氨酸的ROC曲线下面积（AUC）值分别为0.911、0.848、0.909、0.869、0.786、0.597和0.637。由这7种代谢物组成的模型对NSCLC显示出良好的诊断能力（这个诊断模型在每个数据集中的AUC均大于0.9）。该诊断模型在包含混杂因素的验证集2中的特异性为0.970,与其他数据集相似。混杂因素的存在对该模型的诊断准确性几乎没有影响。这个诊断模型在所有I期NSCLC患者和HCs之间的ROC分析显示AUC、敏感性和特异性分别为1.000、1.000和0.988。此外,发现PSAT1、SHMT2、AOC3和MAOB参与了苏氨酸和半胱氨酸的代谢。结论血浆氨基酸和胡椒酰胺具有作为NSCLC诊断生物标志物的潜力。这个代谢生物标志物模型似乎可用于NSCLC的诊断和筛查。此外,代谢组学和转录组学整合通路分析可能有助于阐明NSCLC发生和发展的机制,甚至揭示新的治疗漏洞。