【摘 要】
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目的旨在验证oltipraz(OPZ)能否抑制脉络膜新生血管的形成以及对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移作用的影响并挖掘其相关调节机制。方法体内实验:将40只C57BL/6j雄性小鼠随机分为模型组和治疗组,治疗组给予OPZ处理,模型组给予治疗组等量溶剂(DMSO)处理,预处理1周后,模型组与治疗组皆进行氩激光造模,并继续如前给药,通过FFA检测0天、7天、14天、21天视网膜渗漏情况。体
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目的旨在验证oltipraz(OPZ)能否抑制脉络膜新生血管的形成以及对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移作用的影响并挖掘其相关调节机制。方法体内实验:将40只C57BL/6j雄性小鼠随机分为模型组和治疗组,治疗组给予OPZ处理,模型组给予治疗组等量溶剂(DMSO)处理,预处理1周后,模型组与治疗组皆进行氩激光造模,并继续如前给药,通过FFA检测0天、7天、14天、21天视网膜渗漏情况。体外实验:首先选择HUVECs进行MTT实验,检测出能够抑制HUVECs增殖的最小有效浓度(30uM),以该浓度为中心为接下来的实验设定OPZ浓度范围,再将细胞分为对照组、模型组:VEGFA(20ng/mL)、治疗组:VEGFA(20ng/mL)+OPZ(10uM、30uM、50uM)、进行蛋白印迹法(Western blotting)检测VEGFA表达,利用得到的最小有效浓度进行后续的细胞免疫荧光、Western blottin检测VEGFR2,P-VEGFR2相对表达量的变化、划痕实验检测细胞迁移以及qPCR检测相关miRNA的表达变化;通过转染相关miRNA模拟物(mimics)观察VEGFA的变化,最后通过荧光素酶实验(Luciferase)进行靶基因配对验证。结果体内实验:FFA检测结果显示,与第7天CNV形成相比,在14天、21天两个时间点的激光处渗漏恢复情况治疗组要好于模型组。体外实验:MTT测定结果显示,OPZ从30uM开始出现对HUVEC增殖的抑制作用,而从50uM开始抑制作用趋于稳定。Western blot检测显示,药物组30uM及50uM组的VEGFA蛋白相对表达量低于模型组;利用30uM的药物浓度进行后续实验发现,与VEGFA模型组相比,OPZ在细胞免疫荧光实验同样抑制VEGFA的表达;再次通过WB证明可以抑制VEGFA下游通路蛋白P-VEGFR2的表达;划痕实验抑制了HUVECs的迁移;在qPCR实验中增高了miR-5706的表达量(miR-5706通过3个靶基因预测数据库取交集获得)。WB结果显示转染了miR-5706模拟物组(mimics)的VEGFA表达量低于阴性对照组(NC);荧光素酶实验中,同转染了野生型质粒的miR-5706模拟物组Luciferase活性低于NC组,而在共同转染突变型质粒时二者Luciferase活性未见明显异常。结论MiR-5706直接靶向抑制VEGFA,而Oltipraz可通过调节miR-5706/VEGFA轴抑制HUVECs的增殖、迁徙及脉络膜血管的生成,从而可能延缓湿性年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)的进展。
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