猪链球菌(Streptococcus suis, SS)是一种重要的人畜共患病病原,可引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎等疾病,也可导致生猪从业人员感染和死亡。根据其荚膜抗原不同,猪链球菌有33个血清型(1-31,33,1/2型)。其中猪链球菌2型(SS2)流行最广,致病性最强,其致病机理目前仍然不甚清晰,且近年来,该菌耐药问题愈发严重,亟需研制新型抗菌药来应对。采用转座突变技术,构建SS2强毒株HA9801突变文库,以斑马鱼为模型筛选鉴定荚膜多糖合成相关基因Cps2F等4个SS2毒力相关基因。鉴定并分析猪链球菌自溶素Atl,通过比较基因组及酶谱法筛选到胞壁水解酶LytA,通过BALB/c小鼠体内试验,验证该蛋白治疗SS2感染的效果。1.SS2突变文库的构建及斑马鱼为模型筛选毒力相关基因构建转座子pSET4S-miniTn4001,利用随机转座技术获得SS2突变文库。采用斑马鱼为模型筛选该文库,以期获得毒力致弱株,从而鉴定SS2毒力相关基因。斑马鱼筛选500株SS2突变菌株,毒力下降最明显的4株用于鉴定转座位点。鉴定的转座位点进行缺失,比较缺失株与转座突变株对斑马鱼的LD50。鉴定出4个SS2毒力相关基因：荚膜多糖合成相关基因(Cps2F)、转录调节因子(tr66)、TetR家族调节蛋白(TetP)和假定的保守蛋白(chp).这些基因的缺失造成SS2对斑马鱼LD50由5.28×104cfu/fish分别升至7.64×107cfu/fish,7.48×105cfu/fish,8.98×105cfu/fish和2.16×106cfu/fish。Cps2F与SS2荚膜多糖合成相关；TetP是调控蛋白,调节细菌转录及毒力因子表达；tr66与细菌糖代谢调节相关；chp为假定保守蛋白。斑马鱼筛选SS2突变文库得到的毒力相关基因,能加深对猪链球菌致病机理的认识并有助于SS2疫苗的研制。2.SS2自溶素Atl的鉴定与功能分析基因atl编码SS2的自溶素。Atl蛋白含1025个氨基酸,分子量为113kDa,分析结构发现含保守的“N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶”结构域。试验发现Atl具有溶解SS2细胞壁活性及纤维蛋白原结合能力。构建atl缺失株HA9801△atl分析Atl生物学功能。HA9801SDS提取物中有两条胞壁溶解蛋白条带,缺失atl造成它们的消失,证实两个水解蛋白皆由atl编码。缺失株与野毒株相比：细菌的链长显著延长,几乎丧失自溶活性,生物被膜的形成是野毒株的700%,对HEp-2细胞的粘附能力下降50%,对斑马鱼的LDso上升5倍。鉴于Atl具有溶解胞壁活性及纤维蛋白原结合能力及atl缺失对SS2的影响,推测Atl是HA9801的主要自溶素,它参与该菌的自溶,细菌的分裂,生物被膜形成,细胞粘附,并与HA9801的毒力相关。3.SS2胞壁水解酶LytA鉴定及其溶菌活性分析酶谱试验分析猪链球菌2型(SS2)强毒株HA9801及无毒株T15胞壁水解酶,发现T15独有的25KD胞壁水解酶,其活性明显强于其他胞壁水解酶。T15基因组测序,与强毒株比较,筛选差异基因。Blastn分析,一大小为720bps的ORF与化脓链球菌噬菌体相关胞壁水解酶存在同源性,命名为LytA.该基因仅在T15中存在,其他SS未见分布。酶谱证实原核表达的重组蛋白LytA存在溶胞壁活性,缺失LytA后T1525kDa处的溶解条带消失,证实LytA编码T1525kDa的胞壁水解酶。Western分析发现LytA具有免疫原性。体外溶菌试验,LytA在15min内将HA9801OD600值由1.0降至0.003,活菌数从5.0×108cfu/ml降至4.1×106cfu/ml。平板溶菌试验,重组蛋白LytA对检测的SS2菌株产生明显溶菌圈。LytA溶菌的高效性及迅速性,使其成为治疗SS2感染的新型抗菌制剂。4.胞壁水解酶LytA应用于SS2感染的治疗以BALB/c小鼠为模型,通过静脉注射疗法,评价胞壁水解酶LytA治疗SS2感染的效果。静脉注射2,000μg LytA,15min内血液细菌滴度的Log值由7.48降至6.07。4.5×108CFU HA9801感染后1h,静脉注射LytA BALB/c小鼠存活率为90%,PBS组全部死亡。为验证LytA对SS2败血症治疗效果,HA9801感染后5h、10h两次注射LytA,小鼠的存活率为50%,说明及时,多次注射LytA能够有效治疗SS2感染。该蛋白具有免疫原性,兔高免血清的体外试验证明抗体的产生只能部分阻断不能完全中和LytA溶菌活性,且抗体的产生对LytA体内杀菌效果影响不显著(p>0.05)。检测LytA溶菌谱发现,LytA能够有效裂解SS诸多血清型及其他革兰阳性及阴性菌,其中SS2最为敏感。胞壁水解酶LytA是非常高效的抗SS2制剂,有望成为应对SS2感染的新武器。