论文部分内容阅读
自然界中木质素的降解主要是通过丝状真菌,尤其是白腐菌的分解作用来完成的。白腐菌降解木质素,是通过其分泌的酶的作用来实现的。白腐菌所分泌的木质素降解酶主要有3种,即木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,与其它氧化酶相比具有更大的实际应用价值。漆酶来源于植物、真菌和细菌,具有特殊的催化性能和广泛的作用底物,在木素降解、生物制浆、生物漂白、环境保护、生物传感器制作、有机合成、食品及饮料加工等领域具有广阔的潜在的应用价值和应用前景。
本论文首先以本实验室分离的白腐菌为出发菌,采用原生质体融合和紫外线照射诱变选育漆酶高产菌株,诱变菌株的漆酶活力达172901U/L,比出发菌株高约7.5倍,经过传代5代,遗传性状稳定。固体稻草发酵添加微量元素100-200mg/L,可提高菌株的产漆酶能力。
诱变菌株在木屑麸皮培养基中培养9-10个星期,长出子实体,子实体菌盖有粗毛,呈白色到浅粉红色,肉质为白色,干后为革质,并观察了供试菌担孢子形态,孢子印为白色,担孢子呈椭圆形,无色,表面平滑,明显有缘囊状体及侧囊状体。比较氯化苄法、饱和酚法和CTAB(十六烷基三乙基溴化氨)法提取供试菌的总DNA,以效果最好的CTAB法总DNA为模板,扩增诱变株菌株的18s rDNA序列,与野生革耳菌Panus rudis的同源性最高,为99%。结合子实体和担孢子形态及菌株18s rDNA序列比对结果可鉴定,本实验室诱变选育的菌种为贝壳状革耳菌P.conchatus。通过进化树分析可知,P.conchatus与P.rudis的亲缘关系最近。~
通过XPS(X-射线光电子能谱)分析可知,竹子经过贝壳状革耳菌P. conchatus处理25d,表面元素C,O,N的比例发生了变化,化学结构也产生变化。未经生物处理的竹子表面O/C比为0.369,生物处理后O/C为0.383,推断竹子的部分木素被氧化降解,碳水化合物的相对含量增加。C-C、C-O含量减少,C-N、C=O含量增加,由此推断经过P. conchatus处理木素的C-C发生断裂,C-O被氧化为C=O,生物体中的蛋白质使竹子表面C-N增加。采用AFM(原子力显微镜)、LSCM(激光共聚焦扫描显微镜)和SEM(扫描电子显微镜)观察P.conchatus处理前后竹子的形貌可得出,白腐菌处理去除了竹子部分木素,竹子表面变粗糙,细胞壁上出现了孔洞,细胞问出现凹坑,纤维结构变疏松,有利于后续化学处理药液的渗入和残余木素的脱除,减少化学药品的用量,减轻环境污染负荷。P.conchatus固体培养产生的漆酶用于生物漂白,取得较好的效果。酶处理荻苇浆、麦草浆和芦苇浆,LQP浆和OLQP浆的白度达比未经漆酶处理的高,OLQP浆白度分别为83.2%ISO、81.8%ISO和84.1%ISO,Kappa值显著降低,粘度变化不大。本研究为P. conchatus及P.conchatus漆酶的应用奠定了基础。研究了P.conchatus液体培养合成漆酶的条件,探讨了不同土豆培养基、碳源、氮源、碳氮比、微量元素、诱导剂和综合因素对漆酶产生及菌体生长情况的影响。结果表明,在土豆汁、土豆麦麸和土豆豆粉培养基中静置培养23d,P. conchatus的漆酶酶活出现2个高峰,其中在土豆麦麸培养基中培养的效果最好。以葡萄糖为碳源,漆酶的酶活最高,其后依次为麦麸、淀粉、羧甲基纤维素和蔗糖;以麦麸为碳源,菌体生物量最大,接下来是淀粉、葡萄糖、羧甲基纤维素和蔗糖,菌体的生长与漆酶酶活不呈正相关关系。以酒石酸铵为氮源,最有利于漆酶的合成,接着是蛋白胨、豆粉、牛肉浸膏和酵母膏;以酵母膏为氮源,菌体生长最好,接下来依次是酒石酸铵、豆粉、蛋白胨和牛肉浸膏。高氮低碳条件下漆酶的酶活较高,高碳条件有利于菌体生长。2,2-连氮-二-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)对P.conchatus产漆酶的诱导作用最好,其次是愈创木酚,接着是稻草粉和藜芦醇,Tween80对P. conchatus漆酶的产生有抑制作用。通过正交实验综合考察了碳源葡萄糖、氮源酒石酸铵、大量元素和微量元素4个重要的营养因素对漆酶合成和菌体生长的影响,得到最适培养条件为葡萄糖10g/L,酒石酸铵5g/L,大量元素为基础培养基的3倍,微量元素20ml/L。葡萄糖是影响菌体生长的主要因素。
经过硫酸铵沉淀、超滤、DEAE-Cellulose离子交换层析,再经Sephadex G-75分子筛分离纯化后,得到P. conchatus纯漆酶,用SDS-PAGE凝胶电泳分析得知漆酶蛋白分子量为56KDa左右。通过氨基酸测序分析,得到P.conchatus漆酶N-端氨基酸序列,和P.rudis漆酶前15个N-端氨基酸序列的同源性为100%。采用3-Full RACE PCR技术,以Invitrogen RNA提取试剂盒提取的总RNA为模板,扩增P conchatus漆酶基因序列,通过比对得知漆酶基因与P.rudis漆酶的同源性为99%,与其它漆酶基因整体同源性不高。该漆酶基因由1437bp完整ORF(开放阅读框)构成,处于22-1457位,编码479个氨基酸残基组成的成熟蛋白。
本文的研究为今后P.conchatus漆酶基因结构的研究、漆酶的异源表达和基因工程菌的构建奠定了一定的基础,为漆酶在生物制浆、生物漂白和废水处理等领域的应用提供理论支持。