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O型红细胞（red blood cells,RBC）表面不含A或者B抗原,可安全地输给A、B、AB和O型等各型受血者,不会因为ABO血型不合而发生输血反应,因此又被称为“通用型RBC”。将A型、B型和AB型RBC酶解成O型通用型RBC具有重要的临床意义和军事价值,可避免因错误输血引起ABO血型不合导致的输血反应,提高输血安全性,同时消除血液偏型,节约输血成本,增强应急输血保障能力。如果通用型RBC研制成功,有望成为未来输血的主要方式。目前制备通用型RBC主要有两种途径:聚乙二醇衍生物包裹法和糖苷酶酶解法,前者存在聚乙二醇衍生物用量大、价格昂贵、部分人群存在天然抗体等缺点,前景有待验证;而糖苷酶酶解法具有高效、特异、安全、便宜的优点,潜力巨大,其关键是获得适用于血型转变的α-半乳糖苷酶（α-galactosidase,αGAL）和α-N-乙酰半乳糖胺酶（α-N-acetylgalacto-saminidase,αNAGA）。用酶解法制备通用型RBC开始于上个世纪80年代,经过二十多年的探索,已经取得很多阶段性成果,美国Zymequest公司寻找到数个αGAL和αNAGA,目前正在进行临床试验,进展顺利。本实验室在国内率先利用海南Catimor咖啡豆αGAL成功实现B→O血型转变,并已获得SFDA临床试验批文,但是A→O血型转变进展缓慢。本课题的目标和任务就是寻找理想的αNAGA,把A型RBC表面的A抗原和A1抗原酶解为H抗原,实现A→O血型转变。本文采用PCR法,从国内临床标本中的脑膜脓毒性金黄杆菌中克隆出新型αNAGA基因（Genebank录入号: EU495239）。该基因全长1335 bp,含有1个开放阅读框,表达含444个氨基酸的蛋白质。该基因和ATCC 13253号黄杆菌αNAGA基因长度相同,比对结果显示,DNA序列同源性为92.6%,氨基酸同源性为94.6%,两者序列存在差异。应用pET-22b-αNAGA载体构建原核表达系统,在25℃、低转速、0.1 mM IPTG的LB培养基中诱导12 h后,αNAGA获得高效表达,重组酶含436个氨基酸,分子量约49.6 kD,C端含有一个6×His标签。通过Ni2+亲合层析、疏水层析等蛋白质纯化技术获得大量的重组酶,纯度达97%。重组酶经过SDS-PAGE、Western blot、酶活性检测等鉴定实验证明正确。酶性质实验表明,αNAGA的最适温度为15℃～45℃,在4℃～25℃之间稳定;最适pH为6～7,在pH 3～8缓冲液中稳定。K+、Li+、Na+、Co2+、Ca2+、Mg2+、Fe3+等金属离子以及葡萄糖、枸橼酸、甘露醇、腺嘌呤、咪唑、EDTA等对酶活力基本没有影响,Fe2+、Ni2+、Zn2+对酶活力有轻度的抑制作用,而Mn2+则对酶活力有显著的促进作用。αNAGA对底物pNP-α-D-N-乙酰半乳糖胺（ 4-nitrophenyl N-acetyl-α-D-galactosamine,pNP-GalNAc）有高比活力,采用Lineweaver-Burk双倒数法作图得出米氏常数Km=63μM,Kcat=7.47 s-1,Vmax=768μmol/（L·min）,Kcat /Km=118.5 （s·μΜ）-1。在25℃,pH 6.8时,每分钟酶解1μmol pNP-GalNAc生成1μmol对硝基苯酚（4-nitrophenyl,pNP）的酶量定义为1 U,计算出αNAGA的比活力为3.36 U/mg。αNAGA对其它单糖的pNP衍生物无比活力。酶解条件优化实验显示,缓冲液对酶比活力有很大影响,在250 mM甘氨酸缓冲液（pH 6.8）中酶比活高,而在生理盐水、PBS等高盐缓冲液中基本无酶活。酶解RBC的最适pH为6.6～7.2,最适温度为25℃～37℃,最适RBC压积为20%～40%,超过50%时酶活性明显下降。温度对酶解效果有明显影响,在1 mL反应体积、RBC压积40%、酶量0.02 U时,37℃或25℃下完全酶解约需30 min,15℃约需60 min,而4℃需120 min。酶解效果和酶解时间、酶量呈线性关系。αNAGA能酶解A1、A2、A1B和A2B等血型RBC的A抗原和A1抗原,不能酶解B抗原。在1 mL反应体积、RBC压积40%、酶量0.02 U、25℃条件下酶解1 h后,A1或A2型RBC和抗A单抗、抗A1单抗、人源O型血清反应不凝集,而和抗H单抗凝集增强。酶解后RBC形态正常,与未酶解RBC相比未见差异。取10例A1型新鲜RBC样本,依上述条件酶解后,每例RBC分别和A1、B、A1B、O型血清各5例采用盐水法、聚凝胺法和抗人球蛋白法按照标准操作程序进行主侧配血试验,结果均为阴性,无凝集和溶血现象,表明酶解后的A型RBC可以安全输给O、A、B、AB等各型受血者,不会因ABO血型不合发生输血反应。用稀有血型抗体检测发现,A1型和A1B型RBC酶解前后主要稀有血型不变。在1 mL反应体积、RBC压积40%、酶量0.02 U、25℃条件下酶解RBC,流式细胞仪检测表明A2和A2B型RBC表面的A抗原10 min即基本消失,A1和A1B型RBC表面的A和A1抗原60 min基本完全消失,下降到O型RBC水平,而H抗原明显增加,和O型RBC相当。αNAGA对A型或AB型RBC的A抗原的酶解无差异。A1和A2亚型RBC表面A和A1抗原分布的不同决定了两者酶解所需酶量的不同,在25℃、pH 6.8条件下,1 h内完全酶解1单位A1型浓缩RBC（约100 mL/单位）仅需1.5 mg酶,而1 h内完全酶解1单位A2型浓缩RBC仅需0.4 mg酶。国外报道的ATCC 13253黄杆菌来源的αNAGA在26℃下1 h完全酶解100 mL A1型和A2型浓缩RBC分别需要30 mg和7.5 mg酶,用量约是本文的20倍。经过洗涤后RBC中残存的微量血清、ACD-B RBC保养液和MAP RBC添加液组分（包括枸橼酸、枸橼酸钠、葡萄糖、磷酸二氢钠、腺嘌呤、甘露醇等）不影响酶活。联合应用αNAGA和海南Catimor咖啡豆来源的αGAL酶解A1B型和A2B型RBC,酶解后的RBC与抗A单抗、抗A1单抗、抗B单抗、人源O型血清均不凝集,流式细胞仪检测发现AB型RBC表面的A抗原和B抗原基本完全消失,H抗原增加,细胞呈现O型RBC免疫学特征。综上所述,脑膜脓毒性金黄杆菌来源的新型αNAGA是十分理想的A→O血型改造的工具酶,能够在中性pH、室温条件下,高效、特异、完全酶解A1型、A2型、A1B型或A2B型RBC表面的A抗原和/或A1抗原,实现A→O或者AB→B血型转变。αNAGA在应用中具有比活力高、酶用量少、操作简便、成本低、易于实现自动化等优点,具有很好的应用前景。