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手性醇及其衍生物是重要的手性中间体,在合成手性药物、手性农药和液晶材料等众多化工产品中应用广泛。酶和微生物细胞作为生物催化剂用于高效制备手性醇已经受到广泛关注。羰基还原酶作为一类重要的氧化还原酶,能够催化潜手性羰基化合物不对称还原,是制备光学纯的手性醇的重要催化剂。本课题组前期研究工作中筛选获得一株醋酸杆菌Acetobacter sp.CCTCC M209061,该菌所产的羰基还原酶能够遵循反-Prelog规则催化多种潜手性羰基化合物不对称还原,具有宽阔的底物谱和良好的立体选择性。然而,一方面,该野生型醋酸杆菌需要大量的氮源维持生长,并且细胞内酶活力和细胞生物量偏低;另一方面,野生菌中酶系复杂,在一定程度上增加了对羰基还原酶分离纯化及进一步研究的困难。因此,针对上述问题,本研究首先采用基因工程手段,将该醋酸杆菌的关键羰基还原酶基因克隆并高效表达于大肠杆菌中;然后,分离纯化重组表达的羰基还原酶,系统研究其酶学性质;根据其不足,采用定点突变对其进行分子改造;最后,将获得的羰基还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶共表达于大肠杆菌中,并将该重组菌应用于催化潜手性羰基化合物不对称还原,建立高效绿色的手性醇不对称合成体系。通过基因工程手段获得醋酸杆菌Acetobacter sp.中羰基还原酶AcCR的关键基因,该基因为762 bp核苷酸组成的完整开放阅读框,编码253个氨基酸,单亚基分子量约27 kDa。经序列比对分析确定该酶属于短链脱氢/还原酶（SDRs）。该酶分子具有典型的Rossmann结构,N-端存在G-x-x-x-G-x-G辅酶结合序列,中间部分存在S-xn-Y-x-x-x-K催化三联体。将该酶基因构建到含有GST标签的载体上,经优化表达条件,得到BL21（DE3）（pGEX-accr）细胞内重组AcCR比活力和细胞生物量分别可达425.7 U/g-dw和1.57 g/L,与原始醋酸杆菌相比羰基还原酶比活力和细胞生物量分别提高了10.78倍和1.43倍。酶学性质研究表明,重组AcCR可以利用NAD（H）和NADP（H）为辅酶,既能催化羰基化合物的还原亦能催化相应醇的氧化,更倾向于以NAD（H）为辅酶,进行氧化还原反应。该酶热稳定性良好,在35 oC和45 oC时的半衰期分别为25.75 h和13.93 h;在pH6.5的缓冲液中最为稳定,4 oC保存96 h,相对酶活仍在80%以上。AcCR属于非金属酶,Mn2+、Mg2+、Zn2+等金属离子对重组AcCR没有显著的激活作用,EDTA对其没有明显抑制作用。研究巯基试剂对重组AcCR活性的影响,结果表明该酶的活性中心无重要的巯基基团和二硫键。重组AcCR的底物特异性研究表明其对于芳香酮、脂肪酮及β-酮酯等具有良好的还原活性及立体选择性,且更倾向于羰基的还原而不是醇羟基的氧化,更有利于手性醇的制备。通过同源建模、分子对接等分析羰基还原酶AcCR的结构特点,预测突变热点,半理性设计该酶的突变体。通过定点突变得到AcCR突变体mut-E144A/G152L、mut-G152L/Y189N和mut-I147V/G152L。突变体对4’-氯苯乙酮（mut-E144A/G152L）、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯（mut-G152L/Y189N）和2-羟基苯乙酮（mut-I147V/G152L）的活性分别提高17.9倍、61.3倍和17.4倍。AcCR突变体可催化芳香酮、脂肪酮、β-酮酯等多种羰基化合物进行不对称还原反应,具有良好的底物特异性和立体选择性,底物浓度提高至200 mmol/L,产物产率可达76.8%至99.1%,产物e.e.值均达到99%以上。通过将羰基还原酶突变体mut-I147V/G152L与葡萄糖脱氢酶（GDH）共表达,获得重组大肠杆菌BL21（DE3）（pETDuet-gst-mut-accr-gdh）。该重组菌既可催化羰基化合物的不对称还原同时又可实现辅酶的原位再生,细胞内羰基还原酶的比活力可达420.9 U/g-dw。该菌应用于催化2-羟基-苯乙酮的不对称还原反应的最适缓冲液pH、反应温度、底物浓度、细胞浓度、葡萄糖与底物的最适摩尔比分别为6.5、35 oC、250 mmol/L、15 mg-dw/m L和1.5。在该条件下,该重组菌催化2-羟基苯乙酮不对称还原的反应初速度、产率及产物e.e.值分别为4.22 mmol/L/min、94.7%和>99%。在C4MIMI·PF6/缓冲液体系中,BL21（DE3）（pETDuet-gst-mut-accr-gdh）催化2-羟基苯乙酮不对称还原的最适底物浓度提高至450 mmol/L,该反应的初速度、产率及e.e.值分别为6.74 mmol/L/min、92.0%及>99%,时空产率提高1.46倍。将该反应体系的规模扩大至100 mL,产物的终产率可达90.5%,产物e.e.值保持不变。本研究不仅阐明了一种羰基还原酶的酶学性质,丰富了对来自醋酸杆菌羰基还原酶的认识;还通过分子改造提高了该羰基还原酶的催化活性,为全细胞催化手性醇的高效绿色合成及其工业应用提供了基础。