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本研究分析了冷冻保存对牛精子蛋白表达的影响，探索了牛精液冷冻损伤的分子机理，为提高牛及其它物种的精子冷冻效果提供参考。通过对几种不同的制备精子全蛋白的方法、不同染色方法及各个方法的重复性进行比较，最终选择Trizol法作为精子蛋白制备的方法。应用固相pH梯度（Immobilized pH gradient，IPG）胶条和双向凝胶电泳技术（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE），采用硝酸银染色法，利用Image MasterTM 2D Platinum软件进行图谱分析。结果检测出约1 600多个蛋白质点，蛋白质分子量基本分布在10～100KD，等电点约为pH4～9的区域内。同时，对等电聚焦（Isoelectric focusing，IEF）和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodiumdo-decylsufate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）中出现的具体问题进行分析，初步建立了牛精子蛋白表达的二维电泳图谱。采用已经建立的精子二维电泳方法，对牛新鲜精子和冷冻精子进行分析。结果获得了背景清晰、分辨率高、重复性好的鲜精和冻精蛋白的双向凝胶电泳图谱，鲜精和冻精蛋白质点数为：1681个和1513个，其匹配率达59.6％和75.7％。冻精蛋白质点有10.2％的缺失，两组存在显著性差异（p＜0.05）。其中选取鲜精组和冻精组8个差异点，5个蛋白质点在冻精中表达下调，3个蛋白质点在冻精中表达缺失，以备下一步的质谱分析。对得到的鲜精和冻精差异蛋白质点的鉴定，将为揭示精子冷冻的机理提供实验依据，为进一步提高牛精液冷冻保存效果提供参考，为进一步提高猪、马、羊等物种精液的冷冻效果提供了理论依据。另外该研究对胚胎的冷冻保存也同样具有比较重要的理论与现实意义。