论文部分内容阅读
【目的】本实验针对导致痛风与高尿酸血症形成的相关酶,对水柳皂苷进行体外黄嘌呤氧化酶(XOD)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPS)、磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(PRPPAT)的活性研究,探讨其防治痛风与高尿酸血症的作用机理。【方法】针对黄嘌呤氧化酶活性,通过荧光分析法评价水柳皂苷体外对XOD的影响。实验采用96孔荧光检测板,设立阳性对照组(别嘌呤醇),终浓度为2.20nmol/ml、4.41nmol/ml、8.82nmol/ml、17.63nmol/ml、35.27nmol/ml、70.53nmol/ml共6个浓度;阴性对照组(DMSO)、待测样品水柳皂苷组,终浓度为4.84nmol/ml、9.68nmol/ml、19.36nmol/ml、40.32nmol/ml、80.65nmol/ml、161.29nmol/ml共6个浓度,每个浓度设5个平行对照;使用荧光化学发光检测仪在激发波/发射波为380nm/440nm处测定各孔荧光值,求得均值,计算抑制率和IC50值,评价水柳皂苷体外对黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测加入不同浓度水柳皂苷24小时后的PC12细胞次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPS)、磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(PRPPAT)基因转录产物含量的变化。本实验于细胞传代第三代加入待测样品水柳皂苷5个浓度:终浓度为4.84nmol/ml、9.68nmol/ml、19.36nmol/ml、40.32nmol/ml、80.65nmol/ml,阳性对照别嘌呤醇低、中、高3个浓度:终浓度为4.41nmol/ml、8.82nmol/ml、17.63nmol/ml,DMSO为空白对照,每个浓度设3个平行对照,24小时后收集经药物处理后细胞提取RNA用于测定。以此来评价水柳皂苷对次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转换酶(HGPRT)、磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPS)、磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(PRPPAT)活性的影响。【结果】所建立的荧光分析法用于水柳皂苷体外黄嘌呤氧化酶的活性检测简便、可靠。显示了水柳皂苷对XOD的抑制作用具有浓度效应依赖性,样品浓度在9.68nmol/ml、19.36nmol/ml、40.32nmol/ml、80.65nmol/ml、161.29nmol/ml的组秩与阴性对照组有显著的差异(p＜0.01),IC50值为11.16nmol/ml。同时测得阳性对照别嘌呤醇的IC50值为11.84nmol/ml。分别对XOD抑制率做图看出,水柳皂苷和别嘌呤醇同样是XOD的抑制剂。RT-PCR方法检测加入水柳皂苷24小时后的PCI2细胞中次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPS)、磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(PRPPAT)基因转录产物含量的变化,体外水柳皂苷对HGPRT mRNA表达影响的结果提示:5个药物剂量组与对照组相比,HGPRTmRNA表达量均显著增高(p＜0.01);体外水柳皂苷对PRPSmRNA表达影响的结果提示:样品浓度在9.68nmol/ml时的组秩与阴性对照有差异(p＜0.05),样品浓度在19.36nmol/ml、40.32nmol/ml、80.65nmol/ml的组秩与阴性对照有显著的差异(p＜0.01);体外水柳皂苷对PRPPATmRNA表达影响的结果提示:5个药物剂量所在组秩与阴性对照均有显著的差异(p＜0.01)。【结论】本研究表明通过荧光分析法、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定水柳皂苷体外对导致痛风相关酶(XOD、HGPRT、PRPS、PRPPAT)活性的检测,结果显示了水柳皂苷有抑制XOD、PRPS、PRPPAT,增强HGPRT的作用。