论文部分内容阅读
目的1.建立分支DNA信号放大技术（branched DNA, bDNA）定量检测乙型肝炎病毒DNA（Hepatitis B Virus DNA, HBV DNA），并评价其性能特点及其临床应用价值，为将该技术应用于HBV感染的诊断和疗效判断奠定基础。2.评价DNA微阵列芯片法检测慢性乙型肝炎拉米夫定和阿德福韦酯耐药突变的性能特点及其临床应用价值。方法1.根据文献报道的中国HBV B、C型基因组全序列，设计一套碱性磷酸酶标记的探针，包括：捕获探针组、特异性捕获剂、标记体、前放大体探针组、放大体探针组和标记探针组，将捕获探针包被在96孔聚氯乙烯板上，依序与HBVDNA、前放大体探针组、放大体探针组、标记探针组杂交，将杂交信号级联放大，用北京源德生物有限公司JETLIA-962型发光仪检测化学发光信号值，计算结果。2.制备标准品：收集5例高HBV DNA载量的HBV感染者血清标本共5ml作为标准品，用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time Fluorescent Quantitativepolymerase chain reaction，RT-qPCR）法连续4天对其HBV DNA进行定量，共定量20次，其平均值1.87E+08copies/ml作为标准品HBV DNA的拷贝数定值。3.优化反应条件，包括改变裂解液含量、裂解液反应时间的改进、探针杂交时间的等；进行线性范围、特异性、重复性及干扰试验。4.检测84例HBV感染者血清中HBV DNA的含量，与RT-qPCR法检测结果比较，评价该方法的临床应用价值。用SPSS11.5统计学软件对结果进行统计学分析。5.收集已经发生拉米夫定（Lamivudine,LAM）或阿德福韦酯（AdefovirDipivoxil,ADV）临床耐药的慢性乙型肝炎（Chronic viral hepatitis type B, CHB）患者血清标本48份，同时采用DNA微阵列芯片法和直接测序法对HBV逆转录区位点rtL180、rtM204、rtA181、rtN236进行检测，比较两种方法检测结果的一致性。结果1. bDNA技术用于HBV DNA定量，线性范围为104copies/ml~107copies/ml；HBV DNA浓度为107copies/ml、105copies/ml、104copies/ml的批内变异系数（Coefficient of variation, CV）分别为：2.60%、1.49%、1.35%；批间CV分别为：11.6%、9.82%、5.61%，重复性好；对丙肝病毒（Hepatitis C Virus, HCV）、沙眼支原体（Chlamydia trachomatis, CT）、单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus,HSV）、人类乳头瘤病毒（Human papillomavirus, HPV）等不出现发光值的特异性增长，特异性好。2.经检测的84份血清样本，两种方法阳性符合率为85.7%（72/84，Kappa=0.694，P＜0.05），HBV DNA平均含量RT-qPCR法为4.24log10拷贝/ml，范围：0～8.36log1（04.24±3.08log10），bDNA法为3.85log10拷贝/ml，范围：0～8.27log10（3.85±3.42log10），RT-qPCR测得HBV DNA平均含量明显高于bDNA法（P<0.05），二法检测结果显著相关（r=0.904，P<0.01）。3.微阵列芯片法和直接测序均成功地检测48份标本中的192个耐药基因型，其中耐药型突变40例，野生型8例，44例标本结果完全一致，2种方法检测HBV突变结果的完全符合率为91.67%。4例标本结果不符：1例用直接测序法测出rtA181T突变，微阵列芯片测出除了rtA181T外的另外2个突变位点（rtL180M，rtM204V）；1例用直接测序法检测出rtA181T突变，微阵列芯片测出除了rtA181T外的另外1个突变位点（rtN236T）；2例用直接测序法检测出rtM204I突变，微阵列芯片测出除了rtM204I外的另外2个突变位点（rtL180M、rtM204V）。结论1.成功建立了bDNA技术用于HBV DNA的定量检测，其结果稳定、准确、可靠，可用于HBV感染的诊断和疗效判断。2. DNA微阵列芯片法检测HBV耐药突变与直接测序法相比符合率高，具有高通量的特点，在微阵列芯片法所覆盖的几个已知突变位点的检测中，微阵列芯片法能检测直接测序法不能检测到的微量突变，适合于耐药的早期诊断。