新城疫病毒(NDV)作为溶瘤病毒之一,其抗肿瘤作用早在上世纪50年代就有人提出。NDV可诱导产生干扰素、白细胞介素等细胞因子,也可以刺激淋巴细胞的分化和改变肿瘤细胞的免疫原性;同时NDV可以激活机体的免疫细胞,使免疫细胞发挥细胞毒性功能从而发挥抗肿瘤的作用。凋亡素(Apoptin)是来源于鸡传染性贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)的小分子蛋白质。凋亡素具有诱导鸡胸腺细胞、成淋巴样细胞系、多种人恶性成淋巴样细胞系和人骨髓瘤细胞凋亡的特性,而对正常的细胞无凋亡作用。凋亡素的抗肿瘤机制不依赖于p53途径,且不被抑凋亡蛋白bcl-2所阻遏。所以凋亡素作为一种潜在的抗肿瘤候选药物,在恶性肿瘤的治疗中具有价值。基于NDV和凋亡素的不同抗肿瘤机制,本研究利用反向遗传技术,以NDV ZJ1毒株为载体,构建了表达CAV凋亡素的重组NDV,并且通过体内及体外抗肿瘤性实验比较了重组病毒和ZJ1毒株的抗肿瘤特性,旨在研究和开发一种抗肿瘤的新型疫苗。1表达CAV凋亡素的重组NDV的构建用特异性引物扩增CAV的凋亡素(VP3)基因,将纯化的PCR产物克隆后得到质粒T-VP3。再根据NDV ZJ1株基因序列设计并合成一对引物,用于扩增NDV P-M基因(2880-4709nt)之间的约1.8kb大小的片段,构建了质粒pUC/NDV。将VP3基因插入pUC/NDV,构建了中间质粒pUC/NDVVP3。pUC/NDVVP3经酶切后,替换到含T7启动子的ZJ1株基因组cDNA克隆(pNDV/ZJ1)的相应部分,得到了含凋亡素基因的重组质粒pNDV-VP3。将质粒pNDV-VP3与NP、P、L真核表达质粒(pCI-NP、pCI-P、pCI-L)共转染BSR-T7/5细胞,拯救出含凋亡素基因的重组NDV。RT-PCR检测结果表明VP3基因已插入到NDV ZJ1株基因组当中;Western blot实验证实,重组病毒能成功表达凋亡素蛋白。2表达CAV凋亡素的重组NDV的抗肿瘤特性研究采用MTT法检测了NDV ZJ1毒株和重组病毒所引起的肺癌细胞A549和肝癌细胞SMMC7721的死亡率,结果表明在相同的作用时间内(48h),随着病毒感染量的增高,两种病毒对肿瘤细胞的杀伤性都有所提高;在病毒感染量相同的情况下,重组病毒对肿瘤细胞的杀伤性要比ZJ1毒株强。病毒的体内抗肿瘤性试验在SMMC7721荷瘤BALB/ c小鼠体内完成。首先在小鼠的腹部皮下注射肿瘤细胞,当肿瘤生长到一定体积时,在瘤内注射ZJ1株病毒或重组病毒,并且定期的测量肿瘤体积,通过绘制肿瘤随时间变化的生长曲线来反应病毒对肿瘤生长的抑制情况。结果表明,重组病毒和ZJ1毒株都很好地抑制了肿瘤的生长;与ZJ1毒株相比,重组NDV对肿瘤生长的抑制性略高。