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研究背景与研究目的:肝纤维化是指由各种致病因素所致肝脏内结缔组织异常增生的一种病理生理过程。肝脏组织的纤维化改变可破坏正常的肝脏结构,形成大量肝小结,改变肝脏血液循环,最终引发肝硬化甚至肝癌。目前,肝纤维化的发病机制尚未阐明,临床上对肝纤维化的治疗也无特效药。因此,积极寻找一种安全有效的肝纤维化治疗方法迫在眉睫。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是在体内广泛分布的一种成体干细胞（Adult stem cells,ASCs）,具有自我更新和多项分化潜能。人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs）是近年来发现的一种新型干细胞,具有来源丰富、增殖能力强、免疫原性低、组织相容性高及安全无致瘤性等优点。已有研究证明,多种组织来源的MSCs均可改善肝纤维化,但hAMSCs对肝纤维化的治疗作用尚不清楚。本课题旨在通过体内及体外实验系统研究hAMSCs对小鼠肝纤维化的治疗作用及其分子机制,从而为肝纤维化的临床治疗提供新线索和实验依据。实验方法:1.hAMSCs的分离、培养及鉴定:1)利用胰酶及胶原酶从新生儿胎盘羊膜分离得到hAMSCs单细胞悬液并进行常规培养;2)利用流式细胞术、RT-PCR及免疫荧光对hAMSCs进行分子标志物检测;3)利用成骨成脂分化实验检测hAMSCs的体外多向分化潜能;4)利用NOD-SCID小鼠体内移植实验及软琼脂集落形成实验检测hAMSCs体内及体外致瘤性。2.hAMSCs移植对肝纤维化的影响:1)肝纤维化模型的制备:通过腹腔注射CCL4构建肝纤维化模型;2)hAMSCs移植:将带有GFP标志的hAMSCs经尾静脉移植进入肝纤维化小鼠体内,利用活体成像检测hAMSCs在肝纤维化小鼠体内的存活及迁移;3)肝脏的形态学及功能检测:取出不同组别（Control、CCL4+PBS、CCL4+hAMSCs）小鼠的肝脏组织、分离血清,观察肝脏形态并检测小鼠肝功能;4)肝脏组织学检测:利用天狼星红染色检测肝脏组织中肝纤维化面积;5)肝脏免疫组化及相关蛋白检测:利用免疫组化、Western blot等方法检测肝脏组织中α-SMA、TGF-β蛋白表达水平。3.hAMSCs或hAMSC-CM对肝星状细胞（HSCs）的影响:1)体外共培养体系:体外构建hAMSCs或hAMSC-CM（条件性培养基）分别与激活态人源肝星状细胞系（LX-2）Transwell共培养体系,实验分为对照组、hAMSCs共培养组及hAMSC-CM处理组;2)蛋白表达的检测:Western blot检测不同组别LX-2中Collagen I、Collagen III、α-SMA、TGF-β、PCNA及BCL-2等蛋白的表达;用β-catenin抑制剂ICG001处理LX-2并检测相关蛋白及α-SMA的表达;3)细胞凋亡实验:利用Annexin V/PI流式细胞凋亡实验和CCK8实验检测LX-2的凋亡及增殖;4)抗体芯片实验:利用抗体芯片检测LX-2-CM、hAMSC-CM以及hAMSCs与LX-2共培养的CM中440种细胞因子的表达,筛选出差异表达候选因子;5)RNA干扰实验:通过si RNA技术敲除hAMSCs中的DKK-1及DKK-3,并将敲除上述基因的hAMSCs与LX-2进行共培养,Western blot检测LX-2中β-catenin信号通路相关蛋白及α-SMA的表达。实验结果:1.hAMSCs具有MSCs的特性:1)羊膜经胰酶及胶原酶消化后,成功分离培养得到扩增能力极强且具有典型MSCs形态的hAMSCs;2)RT-PCR、流式细胞术及免疫荧光检测表明,hAMSCs表达MSCs标志基因（CD29、CD105、CD90、CD73）及胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）标志基因（Nanog、Oct-4、SSEA-4）,低表达主要组织相容性I类抗原（HLA-ABC）,不表达造血干细胞标志基因（CD34、CD45、CD133）及主要组织相容性II类抗原,（HLA-DR）,不表达HLA-ABC共同刺激分子CD80、CD86及CD40,表明hAMSCs具有极低的免疫原性;3)成骨成脂实验发现,hAMSCs可在体外定向分化为骨细胞及脂肪细胞,表明hAMSCs具有多向分化潜能;4)体内外成瘤/致瘤实验研究表明,hAMSCs在体内及体外均无致瘤性。2.hAMSCs移植明显抑制小鼠肝纤维化的发生发展:1)通过连续6周（每周2次）腹腔注射CCL4成功构建肝纤维化小鼠模型;2)活体成像及肝功能检测显示,部分hAMSCs可特异性地迁移至肝纤维化小鼠的肝脏组织,改善肝脏形态及功能;3)天狼星红染色表明,hAMSCs体内移植显著减少小鼠肝纤维化面积;4)免疫组化及Western blot检测表明,hAMSCs体内移植抑制CCL4介导的HSCs激活。3.hAMSCs通过分泌DKK-3、DKK-1抑制Wnt/β-catenin信号通路,进而抑制LX-2激活:1)hAMSCs、hAMSC-CM与LX-2共培养结果显示,LX-2中Collagen I、Collagen III、α-SMA、TGF-β表达显著下降,PCNA、BCL-2表达无明显变化;2)流式凋亡检测及CCK8实验表明,hAMSCs及hAMSCCM处理对LX-2凋亡和增殖无明显影响;3)抗体芯片检测表明,与LX-2-CM相比,hAMSC-CM以及hAMSC与LX-2共培养的CM中含较高水平的DKK-1、DKK3;4)Western blot检测表明,hAMSCs及hAMSC-CM可抑制LX-2中Wnt/β-catenin信号通路中α-SMA、β-catenin及P-GSK3β的表达。在LX-2的培养体系中加β-catenin抑制剂ICG001,显示可显著抑制LX-2的激活;5)利用si RNA技术在hAMSCs中分别敲除DKK-1及DKK-3,并与LX-2进行共培养;Western blot检测表明,DKK-1及DKK-3敲除后可部分消除hAMSCs抑制LX-2激活的作用。结论:1.hAMSCs表达MSCs及ESCs标志蛋白,不表达造血干细胞标志蛋白,具有多向分化潜能、高增殖能力、低免疫原性和不致瘤等特征;2.体内及体外实验证明hAMSCs及其CM是通过抑制LX-2的激活,而不是抑制其增殖、促进其凋亡来抑制肝纤维化;3.hAMSCs可通过分泌DKK-1及DKK-3,抑制Wnt/β-catenin信号通路,进而抑制LX-2激活。