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β4GalT是糖基转移酶β1,4半乳糖基转移酶,其家族共有7位成员(β4GalT1~β4 GalT7),每种β4GalT在不同糖缀合物和糖结构的生物合成中具有不同的功能。目前为止,β4GalT家族中,研究最多的是β4GalT1,也是机体中分布最广泛,非常重要的糖基化转移酶。β4GalT1参与了细胞骨架的构建,细胞-基质间的相互作用,胚胎发育,神经系统发育,免疫及炎症反应,结直肠癌等多种肿瘤的发生发展等过程。虽然,有关β4GalT1功能的研究很多,但都是通过将β4GalT1基因在小鼠体内敲除而进行的,事实证明β4GalT1基因敲除对小鼠的正常生理功能有较大影响。因此本研究考虑将β4GalT1突变成GalNAcT,这样既没有简单敲除β4GalT1,同时也不会在小鼠体内引入不存在的单糖结构,以此考察β4GalT1基因点突变对小鼠生理功能的影响。此外,关于β4GalT1基因突变为GalNAcT后对小鼠体内蛋白质糖基化的影响的研究较少,对小鼠肠道微生物结构的影响研究更是未见报道。因此本文首先通过繁育及基因鉴定,获得实验所需的β4GalT1基因点突变的纯合子、杂合子和野生型小鼠,在此基础上考察β4GalT1基因点突变对小鼠的生长发育、神经发育、繁殖能力、体内蛋白质糖基化等的影响,同时研究了 β4GalT1基因点突变对小鼠肠道微生物的影响以及摄入一定量的人乳和牛乳N-链寡糖对这种影响所起到的可能的改善作用。1.β4GalT1基因点突变对小鼠生理功能的影响对杂合子自交繁殖的子代小鼠进行基因型鉴定,成功得到了实验所需的β4GalT 1基因点突变纯合子、杂合子和野生型小鼠。通过对纯合子、野生型小鼠日常状态的观察,发现纯合子小鼠较野生型小鼠而言,反应迟滞,对外界刺激反应不敏感。通过悬尾试验发现,纯合子小鼠的静止时间显著长于野生型小鼠(P<0.01),说明纯合子小鼠处于抑郁状态的时间更长,证明β4GalT1在神经发育的过程中起重要作用。对纯合子母鼠与纯合子公鼠,纯合子母鼠与野生型公鼠,杂合子母鼠与杂合子公鼠,野生型母鼠与野生型公鼠进行合笼繁殖,发现纯合子母鼠很难受孕,或者受孕以后不能正常生出小鼠,甚至难产死亡。对纯合子、杂合子和野生型小鼠平均每胎子代数量进行统计分析发现,纯合子、杂合子和野生型小鼠平均每胎子代数量分别为0、6±2、9±2只,纯合子小鼠平均每胎子代小鼠数量显著少于杂合子和野生型小鼠(P<0.01),这说明β4GalT1在小鼠繁殖过程中发挥重要的作用,不仅影响小鼠的受精率还与胚胎发育密切相关。2.β4GalT1基因点突变对小鼠血清及小肠蛋白质糖基化的影响提取β4GalT1基因点突变纯合子小鼠和野生型小鼠的血清和小肠N-链寡糖组用于结构解析。利用UPLC、MALDI-TOF-MS对酶解释放的N-链寡糖进行检测,然后结合GU值计算对其结构进行解析并对比发现,β4GalT1基因点突变小鼠血清N-链寡糖结构中只含有少量的半乳糖,但含有一定量的N-乙酰氨基半乳糖,而野生型小鼠血清N-链寡糖结构中含有较多的半乳糖,不含有N-乙酰氨基半乳糖。证明小鼠血清N-链寡糖结构中的半乳糖主要由β4GalT1催化连接到N-链寡糖上,对小鼠进行β4 GalT1基因点突变后,使得小鼠体内β1,4半乳糖基转移酶1活性丧失,虽然这个过程可以由β4GalT家族中其它成员完成,但是由于底物分布的特异性,该过程主要是在β4GalT1催化下进行,所以,对比于野生型小鼠,纯合子小鼠血清N-链寡糖的结构中含有半乳糖的糖链结构显著减少。同时由于引入了N-乙酰氨基半乳糖转移酶基因,因此含有N-乙酰氨基半乳糖的结构增多。基于N-链寡糖的重要生物学功能,纯合子小鼠血液中蛋白质N-糖基化的改变必然改变小鼠的生理机能。通过对纯合子和野生型小鼠小肠中N-链寡糖结构的分析,纯合子小鼠小肠中没有分析出含有半乳糖的寡糖结构,可能是含有半乳糖的结构的含量低而未检测出。而野生型小鼠小肠中含有一定比例的半乳糖的结构,其原因与纯合子和野生型小鼠血清N-链寡糖的结构类似。说明β4GalT1也改变了小鼠小肠N-链寡糖的结构。由于肠道上皮细胞表面的糖链结构是微生物的识别受体,因此肠道N-链寡糖结构的改变也预示着其对肠道微生物结构可能会产生影响。通过纯合子和野生型小鼠血清和小肠N-链寡糖的结构解析可以知道,β4GalT1基因点突变对小鼠体内蛋白质糖基化有重要的影响。3.β4GalT1基因点突变对小鼠肠道菌群的影响及乳N-链寡糖对该影响的改善对纯合子小鼠和野生型小鼠的粪便进行高通量测序分析,结果显示,两组中各有约10%的独有OTU数目,且主成分分析、聚类树分析和差异性分析都说明β4Gal T1基因点突变对小鼠粪便中肠道微生物的菌群结构产生了显著影响。此外,喂食一定量的人乳和牛乳N-链寡糖后,高通量测序结果显示摄入人乳N-链寡糖和牛乳N-链寡糖对野生型小鼠粪便微生物丰度及菌群组成也产生了显著影响。具体而言,β4GalT1基因点突变显著上调了小鼠粪便中Ruminococcaceae UCG 009、RuminococcaceaeUCG010、Parabacteroides、Tannerellaceae等菌属的丰度(p<0.05),而摄入一定量的人乳和牛乳N-链寡糖显著下调了野生型小鼠粪便中R uminococcaceae、Tannerellaceae、Parabacteroides 等菌属的丰度(p<0.05)。β4Ga 1T1基因点突变显著下调了小鼠粪便中RuminococcaceaeUCG014等菌属的丰度(p<0.05),而摄入一定量的牛乳N-链寡糖显著上调了野生型小鼠粪便中Ruminococca ceaeUCG014等菌属的丰度(p<0.05)。故可以推测,通过饲喂β4GalT1基因点突变纯合子小鼠一定量的人乳或牛乳N-链寡糖能够调节β4GalT1基因点突变纯合子小鼠肠道内菌群的失调。