第一部分纳米孔测序技术以及Bionano-DNA光学图谱技术在血友病A携带者基因诊断中的应用目的:血友病A是一种以凝血因子Ⅷ（FⅧ）缺乏或缺陷为表现,发病率较高的遗传性出血性疾病。由于编码Ⅷ因子的F8基因结构复杂性和现有测序技术限制,临床上血友病A携带者（尤其在无法获得先证者样本的情况下）F8基因的致病变异检出率较低,已不能满足产前诊断和辅助生殖的实际需求。为此,本研究引入最新的基因组学技术,包括纳米孔测序技术和Bionano-DNA光学图谱技术对缺少先证者、无法开展连锁分析的血友病A携带者进行基因分析,并尝试将新技术与传统技术相结合形成适合临床应用的技术组套及诊断流程。方法:联合多种直接诊断技术,包括二代测序（NGS）、长片段PCR（LD-PCR）、倒位PCR（IS-PCR）与Sanger测序,以受检者病史为依据建立个性化检测体系,逐项筛查受检者样本F8基因可能存在的点突变、插入缺失变异（InDels）、SVs等。对前述手段仍无法检出的基因缺陷,采用纳米孔测序（Nanopore）以及Bionano-DNA光学图谱技术进一步分析DNA分子复杂结构变异。结果:在不依赖先证者的情况下,纳米孔测序技术、Bionano-DNA光学图谱技术结合传统技术手段在52例血友病A携带者受检样本中,共检出错义突变19例（37.3%）;内含子22 倒位（Inv22）15 例（29.4%）;插入/缺失（InDels）6 例（11.8%）;无义突变4 例（7.8%）;剪接区变异2例（3.9%）;大片段缺失1例（2.0%）;复合变异2例（3.9%）。F8基因缺陷总检出率达96.1%,并检出1例由MCFD2基因纯合变异导致的FV/FⅧ联合缺陷。结论:在血友病A携带者基因检测中,纳米孔测序技术和Bionano-DNA光学图谱技术在杂合大片段缺失、杂合内含子倒位等方面显示出其他技术无法比拟的灵敏度和准确性,与传统技术手段相结合可覆盖F8基因突变谱中的各类变异,显著提高了血友病A携带者基因缺陷的检出率及精准诊断,对实现血友病家系的优生优育、切断致病基因传播链有重要意义。第二部分Ⅷ因子B区遗传缺陷与临床表型相关性分析研究目的:在Ⅷ因子的各结构域中,B区是最大、最具异质性的结构域,其功能尚未被完全阐明。因子Ⅷ活化过程中凝血酶的剪切以及去B区重组Ⅷ因子（BDD-rFⅧ）在临床治疗中的应用,都表明B区并非Ⅷ因子活性表达所必须。然而在临床血友病基因诊断中依然可发现一些血友病患者（甚至重型患者）其Ⅷ因子B区存在变异。这些患者B区的遗传缺陷与其疾病表型之间是否存在关联是本研究所要探索的问题。方法:检索筛查F8基因变异数据库中登记的B区错义突变与相关表型资料,根据ACMG指南从人群频率、denovo变异、蛋白质序列保守性及空间结构等生信维度分析基因变异与临床表型间的关联。收集、分析本院既往诊断的血友病A病例中存在Ⅷ因子B区变异患者临床资料,包括病史、临床特征和既往基因诊断结果,以Sanger测序验证其B区变异位点,以Bionano-DNA光学图谱技术、LD-PCR技术等进一步探查是否存在倒位、大片段缺失等复杂结构变异。结果:在102例本院血友病A病例中共发现9例存在B区变异的中重型患者,经Sanger测序验证得到错义突变5例、无义2例、移码2例,其中错义突变经遗传学工具分析均未表现出明确的“致病性”,无法为患者严重的出血表型做出合理解释。利用Bionano-DNA光学图谱技术、LD-PCR技术发现这5例中有3例存在复杂结构变异,证实这3名患者带有包括B区变异在内的F8基因复合变异。结论:对F8基因变异数据库和本院既往病例的分析发现了 B区变异与临床表型间的不一致现象。对既往诊断为B区变异患者的再次全面检测揭示了在部分患者中存在F8复合变异,其B区变异并非导致其临床症状的主要因素。通过建立完善的F8基因检测体系方可避免致病变异的误诊。