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大黄素(Emodin)是从中草药大黄(Rheum officinale Baill)根茎中提取的主要有效成分,具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化以及清除氧自由基、降血脂、保护肝脏和免疫调节等多种功效。维生素C(Vc)是鱼类必需的营养素,兼有免疫增强和抗氧化的双重功效,但大多数鱼类缺乏合成Vc所需的L-古洛糖酸内酯氧化酶(L-gulonolactone oxidase, GLO),必须从食物中摄取Vc。为了研究大黄素和高剂量Vc对鱼类生长、非特异性免疫以及抗应激的影响,选用我国主要淡水养殖鱼类之一的团头鲂(Megalobrama amblycephala, Yih)作为研究对象,首先分离、克隆出团头鲂两种热休克蛋白70 cDNA的全长序列,并对其基因结构和表达特征进行了分析。然后,在此基础上构建了团头鲂两种HSP70s的原核表达系统,并优化了表达条件,对表达产物进行了纯化和鉴定。同时,选取1200尾健康的团头鲂,体质量(133.44±2.11)g,随机分成4组,其中1组为对照组,投喂基础日粮(Vc含量50.3mg/kg),另外3组为试验组,投喂饲料是在基础日粮中分别添加60 mg/kg大黄素、700 mg/kg Vc、60 mg/kg大黄素+700 mg/kg Vc,每组设3个重复。连续投喂60 d后结束饲养试验,取鱼进行拥挤胁迫、高温应激和感染嗜水气单胞菌的应激试验。1团头鲂两种热休克蛋白70基因克隆与序列分析采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(rapid amplification of cDNA ends, RACE),分别从室温和34℃热激团头鲂的肝脏中克隆到两种热休克蛋白70基因,分别命名为Ma-HSC70和Ma-HSP70基因。它们的cDNA全长分别为2336和2224 bp[不包括poly(A)],分别含有1950和1932 bp的开放阅读框,编码649和643个氨基酸,分子量约为71.24和70.52 kD,理论等电点为5.25和5.30。Ma-HSC70基因在编码区含有7段内含子,所有内含子均遵守GT/AG法则,为组成型HSC70,而Ma-HSP70基因在编码区不含内含子,为诱导型HSP70。氨基酸序列分析表明,Ma-HSC70和Ma-HSP70均含有HSP70家族的3个签名序列,两个部分重叠的双向核定位信号序列(nuclear localization signal sequence, NLS)以及胞质的特征基序EEVD等。同源性分析表明,Ma-HSC70与异育银鲫等脊椎动物HSC70的氨基酸序列相似性高达93.0%以上,而Ma-HSP70与鲫鱼等脊椎动物HSP70氨基酸序列的相似性高达85.0%以上,它们之间氨基酸序列相似性为86.5%。生物信息学分析显示,团头鲂两种HSP70s基因所编码的蛋白以亲水性区域为主,均具有丰富的B细胞抗原位点,无信号肽,为非典型的分泌型蛋白,无明显的跨膜区域；同时还含有众多的蛋白激酶C磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-糖基化位点,推测这些位点在蛋白质折叠,转运,细胞内定位以及细胞信号转导与调控中发挥重要作用。这两种蛋白的二级结构均以a-螺旋和无规卷曲为主,空间结构包括N端ATPase功能域和C端多肽结合功能域。2大黄素和维生素C对团头鲂生长、生理生化指标以及两种HSP70s mRNA表达的影响饲养试验结束后,测定团头鲂的生长性能,并采样检测鱼的肌肉成分、血液和肝脏生化指标以及肝脏两种HSP70s mRNA的表达水平。结果表明,与对照组相比,大黄素、Vc组显著提高了鱼体增重率和特定生长率,血清中总蛋白(TP)、溶菌酶(LSZ)和碱性磷酸酶(AKP)的水平,肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和诱导型HSP70 mRNA的基础表达水平,降低了饵料系数、死亡率、血清中皮质醇(COR)、甘油三酯(TG)以及肝脏丙二醛(MDA)的含量(P<0.05)；配伍组虽然血清中TP、LSZ的含量以及肝脏HSP70 mRNA的水平显著升高,肝脏MDA的含量也显著降低(P<0.05),但均未表现出协同增效作用。此外,与对照组相比,大黄素组还显著提高了团头鲂肝脏过氧化氢酶(CAT)的活性(P<0.05),而Vc和配伍组CAT的活性与对照组的差异不显著(P>0.05)；其它一些指标如血清中葡萄糖(GLu)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、胆固醇(CHOL)、肝脏组成型HSC70 mRNA的表达水平、鱼体形体指标以及肌肉组成成分等各组之间差异均不显著(P>0.05)。3大黄素和维生素C对团头鲂在拥挤胁迫下的生化指标及两种HSP70s mRNA表达的影响饲养试验结束后,从各池中取25尾规格基本一致的团头鲂,进行连续48 h的拥挤胁迫(100g/L)试验,分别于0h、12h、24h、48h取样分析团头鲂血液和肝脏的生化指标以及肝脏两种HSP70s mRNA的表达水平,并统计各组鱼的累积死亡率。结果表明,在拥挤胁迫后,与对照组相比,大黄素、Vc组不同程度地提高了团头鲂血清中TP和AKP的水平,肝脏中SOD和CAT的活性以及HSC70和HSP70 mRNAs的表达水平,降低了血清中COR、GLU、GPT、GOT、TG以及肝脏MDA的水平,而LSZ的活性表现为先下降后升高；配伍组中,这些指标虽然有类似以上的变化趋势,但大多差异不显著(P>0.05),且同样未表现出协同增效作用。此外,各组鱼血清CHOL的水平在拥挤胁迫前后的差异均不显著(P>0.05)。统计表明,大黄素和Vc组鱼的累积死亡率在拥挤胁迫24h、48h均显著低于对照组(P<0.05),而配伍组与对照组的差异均不显著(P>0.05)。4大黄素和维生素C对团头鲂在高温应激下的生化指标及两种HSP70s mRNA表达的影响饲养试验结束后,从各池中取25尾规格基本一致的鱼进行高温应激(34℃)试验。取样检测团头鲂在高温应激前后血液和肝脏的生化指标以及肝脏两种HSP70s mRNA的表达水平,并统计各组鱼在高温应激下的累积死亡率。结果表明,在高温应激后,与对照组相比,大黄素、Vc组不同程度地提高了团头鲂血清TP、LSZ和AKP的水平,肝脏SOD和CAT的活性以及HSC70和HSP70 mRNAs的表达水平,降低了血清COR、GLU、GPT、GOT、TG以及肝脏MDA的水平；配伍组中,这些指标虽然也有类似以上的变化趋势,但大多差异不显著(P>0.05),且未表现出协同增效作用。此外,各组鱼血清胆固醇的含量在高温应激前后的差异均不显著(P>0.05)。统计表明,在高温应激下,Vc组鱼的累积死亡率均显著低于对照组,大黄素组鱼的累积死亡率除6h外,也显著低于对照组(P<0.05),而配伍组与对照组的差异均不显著(P>0.05)。5大黄素和维生素C对团头鲂感染嗜水气单胞菌后的生化指标及两种HSP70s mRNA表达的影响饲养试验结束后,从各池中取15尾团头鲂进行腹腔注射感染嗜水气单胞菌试验,并在攻毒前后采样检测团头鲂血液和肝脏的生化指标以及肝脏两种HSP70s mRNA的表达水平；另从各池中取10尾鱼进行同样的攻毒试验,并统计攻毒后鱼的累积死亡率。结果表明,经攻毒后,与对照组相比,大黄素、Vc组不同程度地提高了团头鲂血清TP.LSZ和AKP的水平,肝脏SOD和CAT的活性以及HSC70和HSP70 mRNAs的表达水平,降低了血清COR、GLU、GPT、GOT、TG以及肝脏MDA的水平；配伍组中,这些指标虽然有类似上述的变化趋势,但大多与对照组的差异不显著(P>0.05),且未表现出协同增效作用。此外,各组鱼血清胆固醇的含量在攻毒前后的差异均不显著(P>0.05)。统计也表明,经攻毒后,大黄素和Vc组鱼的累积死亡率在24 h、48 h均显著低于对照组(P<0.05),而配伍组鱼的累积死亡率与对照组的差异均不显著(P>0.05)。6团头鲂两种热休克蛋白70的原核表达、纯化及鉴定采用PCR方法扩增团头鲂组成型HSC70和诱导型HSP70基因完整的编码区片段,并分别克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,经双酶切和DNA测序鉴定后,将这两种重组表达质粒分别转化大肠杆菌BL21 (DE3),用1 mmol/L IPTG在不同温度及时间下进行诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析,建立最佳诱导表达条件。采用Ni-NTA His Bind Resins亲和层析和DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析对目的蛋白进行纯化,并进行Western-blotting验证。结果表明,成功构建了团头鲂两种重组表达质粒pET-22b(+)/Ma-HSC70和pET-22b(+)/Ma-HSP70,表达融合蛋白的相对分子量均约为72 kD,并能与兔抗人HSP70多抗进行特异性结合,这两种HSP70s融合蛋白经纯化后的纯度均达到95%以上。在较高温度(37℃)下,有利于融合蛋白的快速大量表达,但易形成包涵体；在较低温度(25℃)下,有利于融合蛋白的可溶性表达,但也会降低融合蛋白的表达速度。综合各种因素,本实验选择融合蛋白Ma-HSC70在25℃和Ma-HSP70在30℃下分别诱导7h作为可溶性表达的最佳条件。总之,本研究首次从团头鲂肝脏中克隆到两种HSP70s基因,并对该基因的结构和表达特征进行了分析,确定Ma-HSC70基因为组成型,而Ma-HSP70基因为诱导型。在此基础上成功构建了团头鲂两种HSP70s的原核表达系统,并优化了表达条件,最后得到了纯度在95%以上的两种热休克蛋白70的融合蛋白。这些为进一步研究这两种蛋白的结构和功能以及相应抗体的制备打下了基础。饲养和应激试验则表明,在基础日粮中添加大黄素60mg/kg或Vc 700 mg/kg可促进团头鲂的生长,降低饵料系数,提高鱼体的非特异性免疫力、抗氧化和抗应激能力,减少应激死亡率。二者配伍则效果不佳,其相互作用的机理还有待于进一步的研究。