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研究目的一、尝试以聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒包裹SPIO,并用聚乙二醇来修饰,制备长循环SPIO聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微粒(SPIO-PBCA-PEG);二、在大鼠静脉注射SPIO-PBCA-PEG,并与SPIO对照,考察SPIO-PBCA-PEG肝脏强化效果,并探讨其潜在的应用价值；三、建立大鼠肝肿瘤模型,在模型中静脉注射SPIO-PBCA-PEG,与SPIO对照,进一步评估其对肝脏肿瘤的诊断价值。材料和方法一、SPIO-PBCA-PEG的制备及检测(一)制备工艺的确定精密称取一定量的mPEG,溶于去离子水中,PH控制在5.5-6.5,在机械搅拌器下(800rpm)逐滴缓慢滴加入10ml脂溶性SPIO与一定量BCA单体的混合液,搅拌至少5h以上,终止反应,减压抽滤后用0.22um微孔滤膜过滤,将滤液存于4℃冰箱内备用。(二)正交设计优化制备条件在一定范围内,PH值、mPEG的浓度、BCA单体浓度是影响纳米颗粒粒径大小及其均匀度主要因素,SPIO浓度对其粒径、包封率影响不大。应用L9(34)正交表安排实验(PH值、PBCA、PEG3因素,3个水平),优化制备条件。(三)SPIO-PBCA-PEG铁含量及包封率的测定取上述SPIO-PBCA-PEG混合液5ml,在12000rpm速度下低温离心20min,分别收集上清液及沉淀,用邻二氮菲法测定上清液的Fe浓度,按照下式计算包封率(ER)：ER=(Wa-Ws)/Wa×100%,Wa：加入的SPIO中Fe的含量,Ws为上清液中Fe的含量(四)SPIO-PBCA-PEG粒径及其分布的测定取上述SPIO-PBCA-PEG混合液放置于透析袋内,用5%葡萄糖溶液透析48h,每隔8h换透析液,透出游离的SPIO、mPEG。取透析过的SPIO-PBCA-PEG溶液用Malvern-3000HS激光粒度分析仪测定粒径及其分布：吸取1ml制备的相应样品,用去离子水稀释至量杯中。所选激光光源波长为633.0nm,测试温度为25.00±0.05。(五)SPIO-PBCA-PEG形态观察取少量上述经透析过液体,在透射电镜下观察SPIO-PBCA-PEG大体形态。具体操作方法为：1：4蒸馏水稀释SPIO-PBCA-PEG液体,取1滴放在镀膜铜网上,滤纸吸去多余液体,加入2%磷钨酸染30s,干燥后电镜下观察。(六)SPIO-PBCA-PEG的结构组成测定取上述经透析过液体冷冻干燥,形成粉末状固体,将其放置于红外光谱仪器中,测量其结构组成。二、SPIO-PBCA-PEG大鼠肝脏成像研究(一)实验动物正常SPF级Wistar大鼠12只,由南方医科大学附属南方医院动物实验中心提供,雌雄不限,体重176.5±17.6g,采用随机数字法将其分为二组：1、SPIO-PBCA-PEG组：剂量为0.05mmolFe/kg;2、SPIO组：剂量为0.05mmolFe/kg;(二)MRI扫描方法MRI扫描(GE Signa EXCITE HD 3.0T MR超导型磁共振扫描仪)采用软线圈,冠状及横断面扫描,扫描参数为FSE T1WI (TR/TE=400ms/7.5ms)和T2WI(TR/TE=2800ms/122ms)。平扫后,各组分别于注药后10min、30min、1h、2h、4h及24h各时间点行增强扫描,以绘制SPIO-PBCA-PEG和SPIO肝实质信噪比-时间曲线,扫描参数同平扫。(三)图像分析测量增强前及增强后二组实验动物各时间点T2WI像上肝脏信号强度,在背景区域选取较大的ROI,测背景噪声的标准差(Standard deviation of the noise,SD)。计算肝脏各时间点的信噪比(Signal to noise ratio, SNR)和负性强化率(Enhanced rate, En%)。(四)统计学分析使用SPSS 13.0软件包,采用重复测量的方差分析对比增强前后各组肝脏SNR是否有显著性差异,用独立样本t检验分析增强前后不同时间点两组造影剂肝脏SNR是否有显著性差异。三、SPIO-PBCA-PEG与SPIO在大鼠MR肿瘤成像中对照研究(一)实验动物正常SPF级Wistar大鼠12只,由南方医科大学附属南方医院动物实验中心提供,雌雄不限,体重kg182±15.6g,制备肝脏肿瘤模型(n=12)。(二)动物模型建立大鼠肝肿瘤模型的建立：从VX2荷瘤种兔肿瘤边缘切取鱼肉样组织,剪成0.5-1mm3瘤块,放入少量生理盐水中备用。实验Wistar大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,开腹,暴露腹腔,因大鼠肝脏、脾脏体积小,用手指轻轻将靠近腹壁的肝叶、脾脏轻轻牵出体外,以眼科镊于肝叶较厚位置轻轻刺破组织形成窦道,将1—2粒VX2瘤块埋入其中,确定止血、无瘤块滑出后将肝脏、脾脏送回腹腔,然后逐层关腹。肌肉注射青霉素。2周后用于MR扫描。(三)MRI扫描方法采用随机法将已制成肝肿瘤模型的Wistar大鼠分成SPIO-PBCA-PEG增强Ⅰ组(n=6)和SPIO增强Ⅱ组(n=6)。MRI扫描采用软线圈,冠状及横断面扫描,扫描序列及参数为：FSET1WI (TR/TE=450/7.5ms), FSE T2WI(TR/TE=2800/122ms)。在平扫完毕后,增强Ⅰ组经尾静脉注射SPIO-PBCA-PEG 0.05molFe/kg,在增强后2h扫描；在增强Ⅱ组注射0.05molFe/kg的SPIO,在增强后30mim扫描,扫描参数同平扫。(四)图像分析测量病灶数量、大小,测量病灶及周围肝实质感兴趣区平均信号强度、背景噪声,噪声感兴趣区放在与病灶同一相位编码方向腹前壁之外的邻近背景处。计算每个序列图像上病灶的信噪比(SNR)、病变与肝脏对比噪声比(CNR)、增强前后CNR的变化差值。(五)统计学分析应用SPSS13.0软件包,用配对t检验(Paired-Samples T Test)和独立样本t检验(Independent-Samples T Test),分析两组不同序列肿瘤的SNR、CNR图像增强前后是否有显著性差异,并比较两组增强前后CNR变化差值是否具有显著差异。P<0.05认为有显著性差异。结果SPIO-PBCA-PEG的制备条件为：PH值为6.5,PEG浓度为15%,PBCA单体浓度为1.5%。SPIO-PBCA-PEG含铁量为2.27mg/ml,包封率为86.9%。透射电镜观察SPIO-PBCA-PEG呈类圆形,大小尚均匀,表面平滑完整,有较明显的核—壳结构,可见SPIO被纳米粒包裹。三、激光粒度分析仪测定SPIO-PBCA-PEG平均粒径为177nm,粒径分布为0.20。四、红外光谱学可测出所得药物中同时含有PBCA及PEG特征峰谱,证明所得药物SPIO-PBCA-PEG中PEG连接到PBCA上。五、静脉注射SPIO-PBCA-PEG后10min,30min, 1h,2h,4h,24h T2WI上肝实质SNR与平扫相比有显著性差异,在2h时T2WI肝实质SNR最低,2h后SNR逐渐缓慢上升,但每个时间点肝实质SNR均低于SPIO.静脉注射SPIO后,在第10min,30min T2WI上肝脏SNR较快速下降,30min达负性强化峰值,然后肝实质SNR缓慢上升,上升速率快于SPIO-PBCA-PEG。六、静脉注射SPIO后10min、30min T2WI上肝实质负性强化程度平均为21.3%、48.16%,注射1h后肝实质信号逐渐缓慢恢复。静注SPIO-PBCA-PEG后10min,T2WI上肝实质负性强化程度平均为10.7%,30min、1h、2h、4h、24hT2WI肝实质负性强化程度平均为22.42%,30.69%,56.89%、53.41%、40.99%。与SPIO组肝实质强化方式不同,峰值强化时间晚于SPIO组,但负性峰值强化率高于SPIO。达到峰值后各时间点负性强化率均高于SPIO。七、12例肝脏转移瘤制作成功。SPIO-PBCA-PEG增强后肿瘤—病灶CNR均显著提高,表明SPIO-PBCA-PEG可有效提高肿瘤与病灶的对比度。SPIO-PBCA-PEG提高肿瘤—肝脏CNR的效果可能略优于同等剂量的SPIO,更有助肝脏微小病灶的检查。结论一、SPIO-PBCA-PEG的制备条件为：PH值为6.5,PEG浓度为15%,PBCA单体浓度为1.5%。SPIO-PBCA-PEG粒径为177nm,大体形态呈类圆形,具有明显的核—壳结构,可见SPIO被白色纳米粒包裹。PEG连接到PBCA上。二、静脉注射SPIO-PBCA-PEG后,在T2WI像上大鼠肝脏呈靶向性负性强化,大鼠肝脏最大负性强化幅度达56.899%,其强化峰值出现在2h左右,肝脏信号恢复缓慢,提示SPIO-PBCA-PEG具有长循环作用,其负性峰值强化幅度高于同剂量SPIO。三、SPIO-PBCA-PEG注射可以来增加肝脏-肿瘤CNR,提高肿瘤的检出率。SPIO-PBCA-PEG提高肿瘤—肝脏CNR的效果可能略优于同等剂量的SPIO,更有助肝脏微小病灶的检查。