前言：　　 胰腺癌是一种恶性程度较高、预后极差的肿瘤,其发病率在世界范围内呈逐渐上升趋势。胰腺癌侵袭和转移的机制是研究的重点。探讨其有关分子机制并寻找阻断相关信号通路的药物,对提高胰腺癌的治疗效果具有重要的理论指导意义和临床应用价值。。　　 转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是转化生长因子-β家族成员之一,具有广泛的生物学活性。它在肿瘤的发生发展过程中担任双重角色。在肿瘤早期,主要通过TGF-β1经典的Smads通路介导发挥细胞生长的抑制作用,其中Smad4是该通路中的关键分子,参与信号的入核过程。而在肿瘤晚期,。rGF-β1通过Smad4非依赖通路促进肿瘤的侵袭和转移。TGF-β1主要通过降低胰腺癌细胞粘附力、增加细胞外基质降解以及诱导上皮向间质细胞转化等作用促进侵袭和转移。　　 三羟异黄酮(Genistein)是大豆组成成分之一,具有酪氨酸蛋白激酶抑制剂等多种抗癌作用。它不仅可以促进细胞凋亡,抑制肿瘤生长,还可以抑制肿瘤细胞(如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、结肠癌等)的侵袭和转移。目前,Genisteln在胰腺癌侵袭和转移中作用的研究相对较少。实验表明:Genistein可以改变胰腺癌细胞基因表达、抑制移植裸鼠转移的作用。尽管Genistein抗癌作用的确切分子机制仍不清楚,但它具有抑制肿瘤侵袭的现象已被大量实验证实。为了进一步探讨Genisteiln在胰腺癌侵袭过程中的作用机制,我们应用TGF-β1诱导的人胰腺癌细胞Panc-1作为体外诱导侵袭模型,分别在细胞外基质降解酶、细胞上皮间质变、信号转导通路相关蛋白的表达等方面,探讨Genistein是否具有对抗TGF-β1促侵袭的作用,这不仅可以更加深刻的认识胰腺癌侵袭和转移规律,还可以进一步揭示Genisteln作用机理,为其将来应用于临床提供实验理论依据。　　 目的：　　 通过研究Genisteln对TGF-β1诱导的人胰腺癌细胞Panc-1侵袭力及其相关因素的影响,探讨其在TGF-β1介导的信号通路中发挥的作用,期望为揭示Genisteln作用机制提供实验依据及理论参考。　　 方法：　　 本实验采用人胰腺癌细胞Panc-1为非Smad4纯合子缺失细胞系,对TGF-β1有良好的反应性,是目前国内外用于胰腺癌体外实验研究常用的细胞。　　 采用Transwell小室法检测三羟异黄酮对不同刺激条件下(5ng/ml诱导24小时和10ng/ml诱导48小时)TGF-β1诱导的Panc-1细胞侵袭力和迁徙力的变化;采用半定量RT-PCR技术检测尿激酶型纤溶蛋白酶原激活物(uPA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和9(MMP-9)、波形蛋白(Vimentin)、E-钙依赖粘附素(E-Cadherin)及Smad4的mRNA表达;采用Westernblot蛋白印记法检测uPA、E-Cadherin、P38、磷酸化P38、ERK1/2蛋白表达和采用明胶酶谱法检测MMP-2和MMP-9蛋白活性的表达。采用显微镜观察细胞结构的改变。　　 结果：　　 论文一:Genistejn对TGF-β1诱导Panc-1细胞uPA及MMP-2/9表达的影响　　 1、与空白对照组相比,TGF-β1刺激组(5ng/ml诱导24小时)通过Tanswell小室人工膜细胞数量明显增加,其中侵袭实验60.92±10.71VS34.20±5.52(P＜0.05),迁徙实验67.42±9.09VS40.36±6.10(P＜0.05);uPA、MMP-2mRNA和uPA蛋白表达增加(P＜0.05);MMP-2活性表达显著增强(P＜0.01),MMP-9表达无显著性差异。　　 2、与TGF-β1刺激组相比,各治疗组通过人工膜细胞数减少,其中侵袭实验:各组细胞数为49.03±7.93、37.12±6.27、24.09±3.90,各治疗组抑制率明显增加(P＜0.05),并与浓度呈正比,在GeMsteln浓度为50μmol/L(治疗③组)时P＜0.01;迁徙实验:各组细胞数58.63±9.49、43.56±7.07、27.26±4.36,当Genistein浓度为25μmol/L时,抑制率组间差别具有统计学意义(P＜0.05),浓度为50μmol/L时抑制率更高(P＜0.01)。　　 3、与TGF-β1刺激组相比,各治疗组uPAmRNA表达显著降低(P＜0.05),具有浓度依赖性,当Genistein浓度为50μmol/L时(治疗③组)差别更明显(P＜0.01):uPA蛋白表达减少,其中治疗②、③组差别具有统计学意义(P＜0.05);当Genistein浓度为25μmol/L时可以明显抑制MMP-2mRNA及活性表达,治疗③组差别显著(P＜0.01);MMP-9mRNA及活性表达各组无显著性差异。　　 论文二:Genistein对TGF-β1诱导Panc-1细胞EMT的影响　　 1、与空白对照组相比,TGF-β1刺激组(10ng/ml诱导48小时)通过Tanswell小室人工膜细胞数量明显增加(99.16±11.30VS65.46±8.99;P＜0.05)E-CadherinmPNA和蛋白表达下降,VimentinmRNA表达显著增加(P＜0.05),显微镜下细胞分散,连接松散,部分细胞呈梭形。　　 2、与TGF-β1刺激组相比,各治疗组通过人工膜细胞数分别为49.03±7.93、37.12±6.27、24.09±3.90,当Genistein浓度为50μmol/L时(治疗③组)抑制率显著增加(P＜0.05);治疗组E-CadherinmRNA表达增加在浓度为25μmol/L(治疗②组)时具有统计学意义(P＜0.05):Genistein对E-Cadherin蛋白表达的增加呈剂量效应趋势,当浓度为1μmol/L时组间即有显著性差异(P＜0.05),当浓度增加时(治疗③组)作用更加显著P＜0.01;对VimentinmRNA表达的影响,治疗②、③组表达降低有显著性差别(P＜0.05);在Genistein浓度为50μmol/L时显微镜下细胞形态间质样特性减轻。　　 论文三:Genistein在TGF-β1介导的细胞信号通路中的作用　　 1、与空白对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Smad4mRNA表达、P-P38蛋白表达明显增加,差别有统计学意义(P＜0.05),而P38、ERK1/2蛋白表达无明显改变(P＞0.05)。　　 2、与TGF-β1刺激组相比,在Genistein浓度为25μmol/L时抑制细胞Smad4mRNA表达及磷酸化P38蛋白表达具有统计学差别,当浓度为50μmol/L时(治疗③组)抑制磷酸化P38蛋白表达的作用更加显著(P＜0.01);各组ERK1/2和P38蛋白表达无显著性差别(P＞0.05)。　　 结论：　　 1、外源性TGF-β1可以通过增加细胞外基质降解及促细胞上皮间质变的作用使人胰腺癌细胞Panc-1侵袭和迁徙能力增强。　　 2、Genisteln通过抑制uPA、MMP-2的表达降低TGF-B1诱导的人胰腺癌Panc-1细胞的侵袭和迁徙能力,抑制程度与剂量有关。　　 3、Genistein对TGF-β1诱导的人胰腺癌Panc-1细胞发生EMT具有不同程度的抑制作用,当浓度为50μmol/L时,Genisteln作用明显并降低细胞侵袭能力。　　 4、TGF-β1诱导细胞促侵袭作用与多种信号通路参与有关,Genistein可能在TGF-β1介导的Smads通路及P38MAPK通路中发挥作用。