目的:探索骨组织工程技术在构建方式,移植策略上改良优化方法,以提高组织工程骨移植物构建效率,及种子细胞骨再生效率;以及研究在衰老,骨质疏松,糖尿病等病理状态下骨组织工程技术修复骨缺损的可行性,拓宽其临床适用范围,探索可能的改进策略,并延伸其实用价值。方法:1.使用脱钙骨基质DBM通过粉碎,过筛,冻干的方法制备微载体。将DBM微载体置入旋转搅拌式生物反应器中,与商用化微载体Cytodex3相对比,比较其对骨髓间充质干细胞（BMSC）在反应器中的一体化动态接种,扩增及诱导能力。然后在皮下异位成骨模型中比较两种微载体经过一体化构建后的成骨能力。最后在大鼠颅骨原位缺损模型中验证使用基于DBM微载体构建的微组织修复骨缺损的可行性。2.取28天胎兔来源BMSC,体外扩增后使用alginate水凝胶与3D打印PCL支架相复合,填充至兔桡骨缺损处进行修复,并使用3D打印PCL膜片包裹缺损部位阻挡纤维组织长入。待14天后将成骨诱导后的胎兔BMSC X光下补充注射进入缺损部位,观察在种子细胞移植量相同时,种子细胞分两次移植是否比一次移植具有优势。3.将雌兔去势后饲养12个月,制备绝经期后雌激素缺乏性骨质疏松模型。取28天胎兔来源BMSC,体外扩增后接种在脱钙骨基质DBM上,进行成骨诱导。在去势兔上制备截断性兔桡骨缺损模型,使用成骨诱导后的DBM组织工程骨移植物进行修复。比较DBM复合物对正常和骨质疏松状态下的骨缺损修复能力,研究通用化骨组织工程技术在骨质疏松状态下的可行性4.取孕龄3个月的胎羊,分离BMSC,脐带来源间充质干细胞（UMSC）,以及成年山羊来源BMSC,体外进行扩增,然后与脱钙骨基质DBM相复合,成骨诱导后构建三种不同种子细胞的细胞材料复合物。购置9-10岁的老年白山羊,与2岁的成年白山羊,使用三种不同细胞材料复合物对老年及成年山羊进行颅骨缺损修复,对比6个月后颅骨缺损修复效果。5.使用链脲佐菌素STZ注射SD大鼠腹腔制备2型糖尿病模型,注射后3天空腹血糖>11.1mol为入选标准。然后取新生3天SD大鼠分离BMSC,体外扩增后与脱钙骨基质复合。利用糖尿病大鼠及正常成年大鼠,制备股骨缺损模型,将DBM细胞材料复合物填充修复股骨缺损。对比组织工程骨移植物对糖尿病大鼠及正常大鼠的骨缺损修复能力。结果:1.使用脱钙骨基质DBM制备的DBM微载体与商用化微载体Cytodex 3相比,均对BMSC有较好的扩增能力,同时干性保持不变。虽然单纯扩增能力不如cytodex 3,但是在异位成骨实验中其成骨性能优于cytodex3。同时利用DBM构建的微组织可以以注射方式对颅骨临界骨缺损进行修复。2.1个月时,分步注射组有明显骨连接形成,而一步式移植法未见明显骨连接。3个月时,和一步式移植法均成功修复了兔桡骨缺损。其中骨量平均值高于一步式移植法,无显著性差异。与一次性注射法比成骨量更多,成骨更快。3.3个月时,骨质疏松组及正常组在缺损部位均形成了完整修复。但是骨质疏松组形成的骨量低于正常组。4.6个月时,三种细胞材料复合物对成年组颅骨缺损部位均形成了完整修复。但是对老年组的缺损部位没有形成完整的修复连接。5.3个月时,仅有正常组大鼠有骨连接形成;6个月时糖尿病大鼠组出现骨性连接;空白组均未见明显骨性连接形成。结论:1.DBM-MC可以作为一种新的可植入性微载体对BMSC进行半自动化大量扩增,同时对扩增的BMSC可以维持其干性;DBM-MC与成熟的商用化微载体Cytodex3相比,扩增效率略低,但与MSC复合后在皮下异位成骨环境中具有更优的成骨能力和促血管活性;基于DBM-MC的一体化TEBG构建系统构建出的μTEBGs可以作为注射型组织工程骨的潜在应用选择之一来提高组织工程骨的构建效率。2.分步式注射成骨方式具有可行性,使用分步式注射成骨诱导细胞的方式,可以成功修复截断性大段骨缺损。分步式注射成骨速度快于传统组织工程骨修复方式。3.基于胎龄期BMSC的通用化骨组织工程技术可以对雌激素缺乏性骨质疏松骨缺损有治疗效果,但成骨量不如修复正常个体骨缺损;破骨细胞的活跃是引起治疗效果差异的原因之一4.不同种子细胞构建的组织工程骨复合物均可以对正常年轻的山羊颅骨缺损达到完全修复;对老龄期山羊的颅骨缺损,不同种子细胞构建的组织工程骨复合物均无法达到完全修复;年龄因素对组织工程的骨缺损修复再生效果起重要影响作用5.通用化组织工程骨移植物可以对糖尿病状态下骨缺损进行修复,但是修复速度慢于正常状态下的骨缺损修复速度