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目的:
探讨哮喘小鼠以及哮喘合并呼吸道合胞病毒(RSV)感染、哮喘吸入糖皮质激素治疗后体内CD4+CD25+调节性T细胞数量的改变,以及相关细胞因子IL-10和TGF-β1的变化。了解CD4+CD25+调节性T细胞、IL-10和TGF-β1是否参与哮喘的发病,以及呼吸道合胞病毒感染、吸入糖皮质激素治疗是否通过这一免疫调节机制影响和干预哮喘的发生。
方法:
50只BALB/c小鼠按随机数字表法分为5组。分别为哮喘组(OVA),哮喘合并RSV感染组(OVA/RSV),单纯RSV感染组(RSV),哮喘吸入激素治疗组(OVA/GC),对照组(NS)。OVA组、OVA/RSV组和OVA/GC组采用卵白蛋白(OVA)和氢氧化铝(Al(OH)3)混合液于第0天和第14天腹腔注射致敏,从第21天开始,2%OVA持续雾化激发5天制备哮喘模型,OVA/RSV组在此基础上结合RSV悬液滴鼻复制哮喘合并呼吸道合胞病毒感染模型,OVA/GC组从第20天到第25天于激发前给予雾化糖皮质激素治疗,RSV组仅给予RSV悬液滴鼻复制单纯呼吸道合胞病毒感染模型,NS组给予生理盐水腹腔注射和雾化做对照。所有小鼠于末次激发后24小时取材,收集外周抗凝血,Hank′s液经右心室灌洗小鼠肺脏,右肺中叶固定于4%多聚甲醛(含0.1%DEPC),取肺组织采用胶原酶消化后,于不锈钢细胞筛上研磨、淋巴细胞分离液分离制备肺组织单个核细胞悬液,外周血及肺组织细胞悬液通过流式细胞仪分析CD4+CD25+调节性T细胞占CD4+ T细胞的百分比,酶联免疫吸附试验(ELISA)测血浆中IL-10和TGF-β1水平,固定后的肺组织作病理切片,部分行苏木素-伊红(HE)染色观察炎症改变,部分通过mRNA原位杂交鉴定肺部RSV感染情况。
结果:
1)哮喘小鼠、RSV感染小鼠及哮喘合并RSV感染小鼠外周血及肺部CD4+CD25+调节性T细胞百分率均明显降低(P<0.01),尤其是哮喘合并RSV感染后,降低更加明显。与未经治疗的哮喘小鼠相比,吸入糖皮质激素治疗后的哮喘小鼠外周血及肺部CD4+CD25+调节性T细胞百分率明显升高(P<0.01),升高后的水平与对照组无差异(P>0.05);
2)哮喘、RSV感染、哮喘合并RSV感染及吸入激素治疗哮喘各因素作用小鼠及对照小鼠,外周血和肺部CD4+CD25+调节性T细胞百分率均呈正相关(P<0.01);
3)与NS组相比,IL-10水平在OVA组明显降低(P<0.005),RSV组无明显变化(P﹥0.005),OVA/RSV组则明显升高(P<0.005)。OVA/GC组IL-10水平较OVA组明显升高(P<0.005),升高后的水平与NS组无差异(P>0.05);
4)TGF-β1水平在哮喘小鼠及哮喘合并RSV感染小鼠明显降低(P<0.01),RSV感染小鼠则明显升高(P<0.01),与未经治疗的哮喘小鼠相比,吸入糖皮质激素治疗后TGF-β1水平有所升高,但无明显差异(P﹥0.05),仍较对照组明显降低(P<0.01);
5)哮喘、RSV感染、哮喘合并RSV感染及吸入激素治疗哮喘各因素作用下,外周血CD4+CD25+调节性T细胞百分率与IL-10、TGF-β1无相关性(P﹥0.05)。
结论:
1)哮喘小鼠体内CD4+CD25+调节性T细胞和IL-10、TGF-β1数量和分泌水平降低,尤其是肺部CD4+CD25+调节性T细胞不能有效聚集,使全身和局部对炎症反应的抑制作用减弱,可能是导致哮喘发生的原因之一。
2)单纯RSV感染导致CD4+CD25+调节性T细胞数量降低,TGF-β1水平升高,但对IL-10水平无影响,提示CD4+CD25+调节性T细胞和TGF-β1参与RSV感染的炎症过程。
3)在哮喘基础上合并RSV感染可进一步减少CD4+CD25+调节性T细胞数量和TGF-β1分泌水平,这可能是RSV感染诱发和加重哮喘的免疫机制之一,但IL-10分泌水平反而升高,其具体机制有待进一步研究。
4)糖皮质激素可通过增加CD4+CD25+调节性T细胞及IL-10数量和分泌水平,增强其免疫抑制功能而发挥治疗作用,但对TGF-β1水平影响不大。
5)哮喘、RSV感染、哮喘合并RSV感染及吸入激素治疗哮喘各因素作用下,外周血和肺部CD4+CD25+调节性T细胞百分率变化具有一致性,监测外周血CD4+CD25+调节性T细胞变化情况可以了解肺部变化趋势。