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蚕丝是一种天然蛋白质,主要由丝素和丝胶构成。具有优良的力学性能和生物相容性,被广泛应用于生物材料,尤其是在组织工程方面的应用。当前对丝素蛋白的研究主要在家蚕丝素方面,家蚕丝素不仅具有良好的力学性能和生物可降解性,而且其制备的材料能够很好的支持细胞的粘附、铺展、增殖,还可以诱导干细胞的分化等。然而对野蚕丝素(天蚕和柞蚕)的研究涉及略少。天蚕丝素和柞蚕丝素分子中分布着高度重复的RGD序列,RGD短肽可作为整合素与配体蛋白的相互作用的识别位点,使整合素与配体结合后,把胞外信号传入细胞内,激发细胞相应的功能。若能明确天蚕丝素和柞蚕丝素中RGD短肽序列的生物学功能,将会大大的拓展野蚕丝素作为生物材料的应用。基因工程技术是一种能够全面而系统的研究蛋白的序列-结构-功能之间关系的技术手段。因此,本文采用基因工程的方法将设计的编码野蚕丝素中含有RGD短肽的序列重组克隆,利用大肠杆菌表达系统制备蛋白,经分离纯化后获得单一目的产物,对表达产物进行了定量和定性分析,并进一步研究含有RGD短肽序列的生物相容性。本文完成的工作主要有以下几个方面:(1)将本实验室已构建好的含有编码RGD肽段序列(GSGAGG-RGDGGYGDGSS)的两个系列的表达载体p ET-30a(+)和p GEX-KG转化到大肠杆菌中诱导表达,通过SDS-PAGE电泳鉴定了重组蛋白在大肠杆菌中的表达情况。通过比较发现,p GEX-KG系列的表达载体更能高效率的表达目的蛋白,得到了可溶性的融合蛋白。(2)重点研究了含RGD肽段设计序列4倍([-RGD-]4)和8倍([-RGD-]8)的多肽的p GEX-KG表达载体的优化表达,得到的融合蛋白相应的标记为GST-[-RGD-]4和GST-[-RGD-]8。调查了不同的起始菌密度、不同的诱导剂浓度、不同的诱导表达时间对两种融合蛋白表达量的影响。结果表明融合蛋白GST-[-RGD-]4在起始均密度为OD600=1.5、诱导剂浓度为0.4 mmol/L、诱导表达2小时,融合蛋白的表达量较佳;融合蛋白GST-[-RGD-]8在起始均密度OD600=0.9、诱导剂浓度为0.4 mmol/L、诱导表达3小时,融合蛋白的表达量较佳。(3)大量表达融合蛋白GST-[-RGD-]4和GST-[-RGD-]8,采用GST亲和层析柱分离纯化蛋白,SDS-PAGE电泳和质谱分析显示纯化后得到了纯度较高的单一蛋白。通过BCA蛋白浓度测定法测得每升菌液融合蛋白GST-[-RGD-]4和GST-[-RGD-]8的最大表达量分别约为55 mg左右和52.5 mg左右。(4)纯化后的融合蛋白经Thrombin酶切后释放目的肽段[-RGD-]4和[-RGD-]8,SDS-PAGE电泳和质谱分析结果显示获得的目的肽段的分子量与理论分子量基本相符,这表明设计的肽段序列得到了正确的表达。(5)采用Zeta电位测量显示融合蛋白GST-[-RGD-]4和GST-[-RGD-]8所释放的两种目的肽段的等电点与理论值基本相符合。融合蛋白GST-[-RGD-]4和GST-[-RGD-]8的氨基酸组成分析结果也表明,表达获得的融合蛋白与设计肽段的氨基酸组成是一致的。实验结果间接地表明重组蛋白得到了正确的表达。圆二色光谱分析显示目的肽段[-RGD-]4和[-RGD-]8溶液的分子构象是以α-螺旋结构为主。(6)研究了重组表达的目的肽段与细胞的相容性,与化学合成的RGD肽相比,目的肽段[-RGD-]4和[-RGD-]8更有利于细胞较快的粘附到材料上,细胞的铺展状态较好,对细胞增殖结果没有显著性差异。