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瘦素(leptin)是肥胖基因(obese gene, ob基因)的产物,具有抑制摄食、调节脂肪沉积与能量代谢的功能。Leptin的作用除与肥胖有关外,对多种生理过程都有调节作用,诸如生热作用、免疫系统调节作用、青春期的始动作用、生殖功能等。重组人leptin蛋白对于部分肥胖以及leptin缺乏的个体或脂肪萎缩性糖尿病患者具有一定的疗效。本研究拟通过体外克隆人瘦素蛋白基因,进行体外表达和生物学活性检验并构建重组人瘦素蛋白基因的输卵管特异性载体,定位表达重组人瘦素蛋白的思路,旨意探索建立活体鸡生物反应器生产纯天然药用蛋白的体系探索、新思路。主要研究如下:1.本实验通过提取人白色脂肪组织总RNA,根据发表文献设计一对特异性引物,RT-PCR法扩增人瘦素蛋白基因OB,并定向克隆至pMD19-T载体进行序列分析。结果:与GenBank发表的人瘦素蛋白基因CDS(登录号:NM000230)的同源性为100%,说明所扩增的序列为本实验所要的。2.通过双酶切克隆的人肥胖基因的质粒pMD19-T human leptin,获得人OB基因ORF,定向克隆至原核表达载体PGEX-6P-1,构建重组表达质粒PGEX-OB。经酶切、PCR鉴定和DNA序列检测正确后,转化至E.coli BL21中,构建工程菌株BL21-PGEX-OB。37℃培养,经IPTG诱导后,人瘦素融合蛋白以包涵体形式高效表达。SDS-PAGE分析结果显示,工程菌株BL21-PGEX-OB正确表达了重组人瘦素融合蛋白,所表达的融合蛋白分子为20 KD,大小与理论值相符;IPTG诱导6h,诱导剂IPTG浓度在1mmol/L时,融合蛋白具有最高表达量。Genetool分析结果显示,目的蛋白最大表达量达菌体蛋白总量的30%。3.双酶切克隆的人肥胖基因的质粒pMD19-T human leptin,获得人ob基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建重组人瘦素真核细胞表达载体pcDNA-OB,在3T3细胞中表达重组人瘦素蛋白,并通过小鼠减肥实验来检测人瘦素蛋白生物学活性。RT-PCR结果显示,转染重组质粒的细胞成功表达人瘦素蛋白;注射重组质粒pcDNA-OB小鼠体重与阴性对照组相比明显下降,统计分析显示差异极显著(P<0.01),说明重组人瘦素蛋白具有生物学活性。4.以克隆的人肥胖基因的质粒pMD19-T human leptin,设计带有特异酶切位点的引物,PCR扩增获得具有相应酶切为点的OB基因,定向克隆至输卵管特异性表达载体POV3,经酶切、PCR鉴定和DNA序列检测正确后,静脉注射产蛋高峰期的母鸡,进行暂态表达试验;收集鸡蛋,取浓蛋白Western Blot检测,结果显示在20KD附近有明显的条带,说明重组人瘦素蛋白成功的在鸡蛋内得到表达。综上所述,本实验克隆的人瘦素蛋白基因能在体外成功的表达,并通过小鼠减肥实验验证了其生物学活性;构建输卵管特异性表达载体并且成功地在活体鸡体内进行了暂态表达。这些为进一步研究瘦素的生物学活性以及与一些疾病的相关性奠定了基础。