多基原药材在近五版《中国药典》收载比例逐渐增加且该类药材涉及的中成药品种和中药处方数量庞大,但是不同基原的药材药理活性、有效成分和含量接近并不完全相同,导致即使是同一品种药材也存在质量差异。多基原药材基原物种多为近缘关系,形态特征差异小,使用单基因序列鉴定多基原药材物种效率较低,甚至存在有的基因型序列完全一致。名贵中药材因自然资源稀缺、人工培养困难导致供不应求,致使此类中药材出现伪劣品甚至掺假,严重影响临床用药安全和中药疗效。药材大黄是蓼科植物药用大黄(Rheum officinale)、掌叶大黄(Rheum palmatum)和唐古特大黄(Rheum tanguticum)的干燥根及根茎,是我国重要传统大宗中药材,为典型的一药多源药材。具有泻下功积、清热泻火、凉血解毒,逐瘀通经、利湿退黄的功效,用于治疗实热积滞便秘,血热吐衄,目赤咽肿,痈肿疔疮,肠痈腹痛,瘀血经闭,产后瘀阻,跌打损伤,湿热痢疾,黄疸尿赤等症。不同物种来源的大黄药材因化学成分存在差异导致药理活性和功效差异。为了快速、准确确定三个物种,确保精准入药,首先分别从三个物种的道地产区各获得1株新鲜植株,提取叶绿体基因组DNA,利用二代测序技术测序(next-generation sequence,NGS),经过基因拼接、基因注释对比分析三个物种叶绿体基因组差异。药用大黄叶绿体基因组大小为161,093bp,掌叶大黄叶绿体基因组大小为161,541bp,唐古特大黄叶绿体基因组大小为161,053bp。三个物种共注释出131个功能基因,其中91个蛋白质编码基因,8个rRNA基因,31个tRNA基因,其中7个基因含有1个内含子,2个基因含有2个内含子,18个基因为双拷贝,1个基因三拷贝。分析三个物种叶绿体基因组中简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)的数目和类型,单碱基重复序列比例最大;大单拷贝区(large single copy region,LSC),反向重复区(inverted repeats,IRA和IRB)和小单拷贝区(small single copy region,SSC)的SSR数量不同;多数SSR的长度小于20bp。利用包含大黄三个基原物种在内的23个物种的叶绿体基因组构建进化树,大黄三个基原物种优先聚为一支。根据大黄药材三个基原物种叶绿体基因组信息差异,针对三个物种叶绿体基因组差异较大区域设计21对特异性引物用于筛选能够准确快速鉴定三个物种的候选序列。经PCR扩增、扩增产物测序和扩增序列信息比对,筛选出8对引物的扩增片段通过碱基替换、碱基缺失和碱基插入可以实现大黄药材三个基源物种的准确鉴定。金钱白花蛇(Bungarus multicinctus)是一种具有显著药理活性重要的传统中药,具有祛风,通络,止痉功效,用于治疗风湿顽痹,麻木拘挛,中风口眼?斜,半身不遂,抽搐痉挛,破伤风,麻风,疥癣等症。由于该药材在治疗类风湿性关节炎,癫痫,荨麻疹,颈椎病等方面疗效突出,导致需求量大,致使该品种药材的伪品频繁出现在中药市场。针对金钱白花蛇和常见伪品线粒体基因COI序列设计特异性引物,运用多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)对金钱白花蛇、黄斑渔游蛇(Xenochrophis flavipunctatus)、赤练华游蛇(Sinonatrix annularis)、眼镜蛇(Naja atra)和尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)进行同时鉴定,并根据毛细管电泳信号峰面积相对定量分析混合样品中真伪样品量。运用MLPA方法鉴定五个物种,单一探针和混合探针特异性强,物种之间没有相互干扰,表明该方法特异性强。混合样品中样品DNA比例大于30%可以根据毛细管电泳峰面积推测混合样品含量,混合样品中样品DNA比例小于30%可用于鉴定样品中是否存掺伪。MLPA方法灵敏度高,可以检测到低至2.5ng金钱白花蛇样品DNA和4.375ng伪品DNA。综上所述,通过叶绿体全基因组实现大黄药材三个基原物种的快速鉴定,MLPA方法实现对金钱白花蛇及其常见伪品的同时鉴定,并进行相对定量分析。两个方法基于分子层面对两个中药材品种准确、快速、标准化的鉴定可以验证两个方法的有效性、稳定性和科学性,可以将这两种方法推广应用于其他多基原药材或贵重药材的鉴定。