本文利用草菇不耐低温的特性，将抗冷冻蛋白基因既作为目的基因又作为筛选标记基因遗传转化草菇，探索抗冷冻蛋白基因作为一种新型筛选标记基因来取代有安全隐患的抗性标记基因的可行性，同时期望获得能够稳定遗传的耐寒转基因新菌株。 主要内容及结果如下： 1、以LgpdF<,1>、LgpdR、LgpdF<,2>为引物，采用PCR技术，从草菇菌丝基因组中克隆了Vgpd1(1056bp)和Vgpd2(614bp)两个gpd启动子片段。 2、构建了三个含有抗冷冻蛋白基因(afp)的草菇基因表达载体pAg-afp、pLg-afp和pVsg-afp以及三个双元表达载体pAg-afp<,235>、pLg-afp<,235>和pVsg-afp<,235>． 3、建立了采用夹层培养的方式，挑取转化后生长良好的菌块，在0℃条件下低温处理一定时间，处理后于34℃恢复生长的草菇转化子筛选体系。 4、分别对影响原生质体制备和再生的条件进行优化，确定了最佳草菇原生质体制备和再生条件：以0.6 mol/L的甘露醇作渗透压稳定剂，溶壁酶浓度15 mg/mL，34℃下酶解3 h，以预培养的方式再生。PEG介导转化草菇V51菌丝原生质体，转化后经过低温筛选得到33个pLg-afp拟转化子。选取11个拟转化子进行PCR扩增鉴定和Southern blot检测验证。结果表明：有7个转化子的基因组中整合有外源afp基因。转化表达载体pAg-afp没有得到转化子。 5、分别对影响电激转化效率的电激缓冲液、电激电压等参数进行研究，确立了以ELE buffer II为电激缓冲液，电激电压5kv/cm、5ms电击时间，25μF电容，400Ω的转化参数。电激转化草菇V51菌丝原生质体，经过低温筛选得到4个pLg-afp拟转化子。PCR扩增和Southern blot检测验证结果表明：4个拟转化子中有3个转化子的基因组中整合有外源afp基因。转化表达载体pAg-afp没有得到转化子。 6、优化农杆菌介导转化的参数，结果表明：以OD<,660>为0.15的EHA105为侵染的农杆菌菌株，加入200μmol/LAS进行预培养，侵染菌丝球30min后将外植体转入含有AS为200μmol/L的IMA培养基上，28℃，共培养60hr 为最佳转化条件。以菌丝球为受体，通过农杆菌介导分别用表达载体pAg-afp<,235>、pLg-afp<,235>遗传转化草菇V23、V51菌丝，经过低温筛选得到23个pAg-afp<,235>拟转化子和96个pLg-afp<,235>拟转化子。选择4个pAg-afp<,235>拟转化子和6个pLg-afp<,235>拟转化子进行PCR扩增鉴定和Southern blot检测验证。结果表明：这10个转化子的基因组中均整合有外源afp基因。 7、对继代三次的转基因草菇菌株的生物学特性进行研究，结果表明：与亲本对照V23相比，转基因草菇菌株TV231的生物学特性存在非期望效应；TV232在菌丝特性上存在非期望效应，在出菇特性上实质等同；FV233、YV234在菌丝形态特性和出菇特性上实质等同。与亲本对照V51相比，转基因草菇菌株TV511、TV512在菌丝特征和出菇特性上存在非期望效应；TV513、TV514在菌丝特征上实质等同，出菇特性存在非期望效应。对转基因草菇菌丝的耐寒特性进行研究，结果表明：与其各自的亲本对照相比，八种转基因草菇菌丝均表现出较强的耐寒性能。FV231、TV232、TV233、TV234的F<,1>代孢子萌发菌丝也具有较强的耐寒性能。V23的转基因草菇F<,1>代孢子菌丝的PCR和Southern blot结果表明：aFP基因在TV231、TV232、TV233的F<,1>代内能够稳定遗传。 8、采用“实质等同性”原则对转基因草菇菌丝的营养特性进行分析评价，结果表明：与亲本对照V23相比， TV231的营养成分的含量均存在非期望效应；TV233的营养特性具有实质等同性；TV234除了部分氨基酸的含量外，其它营养成分均具有实质等同性。与亲本对照V51相比，TV511和TV513的营养成分均存在非期望效应；TV514的营养成分均具有实质等同性。与亲本对照V23相比，TV231、TV233、TV234中抗营养因子的含量实质等同；TV511、TV513、TV514中抗营养因子的含量与亲本对照V51实质等同。 综上所述，本研究的进行不但可以培育抗寒耐冻的草菇新品种，而且为草菇作为外源基因的宿主，生产出人们所需要的外源蛋白奠定基础。转基因草菇进行营养特性和抗营养因子的安全性评价，为明确转基因草菇的食用安全性提供理论依据。