我国是肝癌和胃癌高发国家之一。随着对肿瘤生物学特性不断认识的深入,近年来肿瘤诊疗新技术发展迅速,但肝癌和胃癌患者整体预后仍不佳,进展期肝癌和胃癌临床疗效极差。因此研究肝癌和胃癌恶性生长和转移的调控机制具有重要的科学意义和临床价值。肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)学说为认识肝癌恶性生长的机制提供了新的切入点。肝癌干细胞具有极强的自我更新能力,是肝癌恶性增殖的“根源细胞”;因此探索肝癌干细胞自我更新的调控机制,是肿瘤研究的重要课题。表观遗传修饰是基因表达调控的重要机制,在自我更新、增殖和分化等细胞生物学过程中发挥重要作用。组蛋白甲基化修饰作为一种重要的表观遗传修饰方式,其调控异常参与肿瘤等众多疾病发生发展,但在肝癌干细胞自我更新中的作用机制尚不明确。赖氨酸特异性去甲基化酶LSD1(Human lysine specific demethylases l,LSD1)是单胺氧化酶家族主要成员,在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)参与下,LSD1可以特异去除组蛋白H3的K4和K9的二甲基和一甲基(H3K4me1/2和H3K9me1/2)的修饰。既往研究表明,LSD1维持多潜能干细胞(i PS)、胚胎干细胞(ESC)[1,2]和MLL-AF9白血病干细胞致瘤能力,并在多种恶性肿瘤组织过表达,提示LSD1可能参与了肝癌发生发展,在调控包括干细胞特性等多种恶性生物学行为中发挥重要作用。肿瘤细胞侵袭转移是胃癌导致患者死亡的重要原因,而肿瘤的侵袭和迁移是肿瘤转移的最重要的环节,是肿瘤恶性生物学行为之一,因此探讨肿瘤细胞侵袭转移的机制在研究胃癌的发展过程具有重要的意义。表观遗传学修饰特别是组蛋白甲基化在肿瘤的侵袭转移中具有最重要的作用。已有研究表明,在肿瘤的发生发展中LSD1起到重要的作用,在促进肿瘤增殖和转移等恶性生物学密切相关。例如,LSD1与Snail1的SNAG结构域结合,抑制E-cadherin基因的表达,促进上皮间质转化(EMT)和侵袭转移。但是,目前尚不清楚LSD1是否调控胃癌细胞侵袭转移,研究相关分子机制,有望进一步揭示调控胃癌侵袭转移的表观遗传学机制。有鉴于此,本研究第一部分主要探讨LSD1调控肝癌干细胞的自我更新特性的分子机制;第二部分研究lsd1在胃癌侵袭及转移中的作用及分子基础。研究内容和主要结果结论如下:第一部分lsd1调控lgr5+肝癌细胞的“干性”的分子机制一、lsd1在肝癌组织中的表达及临床肿瘤学意义1、肝癌细胞高表达lsd1;2、lsd1在肝癌组织的表达与病理分级、淋巴结转移相关,且分化程度低及淋巴结转移的癌组织lsd1表达高;3、肝癌组织高表达lsd1与患者五年生存率较低显著相关。二、lgr5+肝癌细胞具有“干性”特征1、肝癌组织lgr5表达与lsd1表达密切相关(1)lgr5在肝癌中表达比癌旁组织高,lgr5与肿瘤的包膜完整性、病理学分级、淋巴结转移、tnm分期及lsd1表达呈正相关;lgr5表达越高的病人生存期越短;(2)lgr5在肝癌细胞株和原代细胞中表达比肝永生化细胞株l02高。2、lgr5+肝癌细胞具有肿瘤干细胞特性(1)lgr5+肝癌细胞干性基因表达较高;(2)含血清培养后,干性基因表达水平降低,分化成熟肝细胞的标志物升高;(3)lgr5+肝癌细胞体外成球能力高于lgr5-细胞;(4)lgr5+肝癌干细胞比lgr5-肝癌细胞具有更强的化疗抵抗能力;(5)lgr5+肝癌细胞体内成瘤能力显著强于lgr5-细胞。三、lsd1调控lgr5+肝癌干细胞的“干性”特征1、lgr5+肝癌干细胞的lsd1表达水平显著高于lgr5-肝癌细胞;2、过表达lsd1能够促进肝癌细胞的自我更新能力及化疗药物抵抗;3、在lgr5+肝癌干细胞中,干扰lsd1表达则降低其自我更新能力及化疗抵抗;四、lsd1上调wnt通路活性,维持lgr5+肝癌干细胞的“干性”特征1、lsd1通过降低prickle1和apc基因启动子周围h3k4me1/2水平,抑制prickle1和apc的蛋白表达,激活wnt信号通路;2、wnt信号活性在lsd1维持lgr5+肝癌干细胞“干性”特征发挥重要作用;五、lsd1抑制剂可以作为肝癌化疗药物的增强剂1、lsd1抑制剂上调prickle1和apc表达水平;2、lsd1抑制剂抑制肝癌干细胞成球能力;3、lsd1抑制剂抑制肝癌干细胞化疗药物抵抗;4、在裸鼠体内,lsd1抑制剂治疗降低肝癌干细胞成瘤能力,抑制肝癌干细胞化疗药物抵抗;第二部分lsd1促进胃癌侵袭转移的机制研究一、lsd1在胃癌中的表达及意义1、胃癌组织高表达lsd1;2、胃癌组织lsd1表达水平与病理学分化程度、肿瘤侵润深度、淋巴结转移和tnm分期显著相关;3、lsd1表达高的病人五年生存期较短。二、lsd1促进胃癌细胞侵袭转移能力1、敲除lsd1后,可抑制胃癌细胞侵袭和迁移能力;2、lsd1抑制剂处理,可降低胃癌细胞侵袭转移能力;三、lsd1调控胃癌细胞侵袭转移的机制1、过表达lsd1降低wisp-2基因启动子区域h3k4me1/2水平,抑制其转录和蛋白表达,促进tgf-β信号通路活化;2、内源性lsd1抑制wisp2基因转录,促进内源性tgf-β信号活性;3、lsd1抑制wisp2,增加胃癌细胞对tgf-β所调控emt的敏感性;4、lsd1增加胃癌细胞对tgf-β所调控侵袭转移的敏感性;四、lsd1和wisp-2在胃癌组织的表达水平及其临床意义1、胃癌细胞wisp-2表达水平与胃癌恶性程度相关;(1)wisp-2在癌旁组织呈阳性,而在癌组织和转移灶组织可见不同程度的低表达表达,且转移灶的表达总体较低;wisp-2表达在细胞浆和膜;(2)相同胃癌组织连续切片ihc染色发现,相同视野lsd1高表达,而wisp-2低表达;分析不同患者胃癌组织则表明,lsd1高表达癌组织中wisp-2低表达,而lsd1低表达癌组织则wisp2高表达。2、wisp-2蛋白在胃癌组织的表达与临床病理学的相关性(1)在307例胃癌临床样本中,统计结果显示wisp-2的表达与病理学分化程度、肿瘤侵润深度和淋巴结转移显著相关;(2)lsd1在胃癌的表达与其发生和演进相关。3、lsd1联合wisp-2的表达对胃癌患者对患者预后和转移的影响(1)WISP-2低表达组织的患者五年生存率低于高表达患者;(2)WISP-2高表达患者无转移生存期高于低表达患者;(3)肿瘤中WISP-2高表达并且LSD1低表达时患者生存时间最长;而癌组织LSD1高表达且WISP-2低表达,则患者生存时间最短;(4)癌组织LSD1低表达且WISP-2高表达时患者没有转移生存时间是最长的;而LSD1高表达并且WISP-2低表达的患者,其无转移生存时间是最短的;(5)联合分析LSD1与WISP-2表达水平,可以更好地预测胃癌患者预后和发生转移概率。综上所述,本研究的主要结论是:1、LSD1在维持肝癌干细胞的自我更新和高致瘤性中具有重要的作用。2、LSD1通过降低Prickle1和APC基因启动子区域H3K4me1/2水平,抑制Prickle1和APC基因表达,增加WNT信号通路活性,参与维持肝癌干细胞自我更新和高致瘤性。3、LSD1抑制剂可以作为肝癌化疗药物的增强剂。4、LSD1促进胃癌细胞侵袭转移。5、LSD1通过降低WISP-2启动子区域H3K4me1/2水平,激活TGF-β信号通路,促进胃癌的侵袭转移。本研究首次报道了LSD1维持肝癌干细胞“干性”特征的作用机制,进一步深入认识了肝癌干细胞化疗耐药的分子机制。LSD1维持肝癌干细胞维持自我更新的分子机制为:LSD1通过修饰APC和Prickle1基因启动子区域的H3K4me1/2,抑制APC和Prickle1蛋白的表达,激活WNT信号通路。我们认为,LSD1可能是肝癌治疗的一个潜在分子靶标。本研究首次阐述了LSD1促进胃癌侵袭转移的作用新机制。其促进胃癌侵袭转移分子机制为:LSD1通过降低WISP-2启动子区域H3K4me1/2水平,抑制WISP-2基因表达,激活TGF-β信号通路,促进胃癌的侵袭转移。因此,LSD1/WISP-2信号轴可能是抑制胃癌侵袭转移的候选干预靶点。