研究背景：　　 随着社会人口的老龄化，心血管疾病已成为严重威胁人类健康的主要疾病。多种心血管疾病如心肌梗死、慢性充血性心力衰竭、心房颤动、高血压心脏病、糖尿病性心肌病变、心肌病及心肌炎等，都伴有心肌纤维化(myocardialfibrosis，MF)过程。心肌纤维化在心血管疾病，尤其是心力衰竭的发生和发展中有十分重要的作用，或许能成为心力衰竭治疗的一个新靶标。　　 目前研究认为，心肌纤维化的发病机制主要与肾素-血管紧张素-醛固酮系统、氧化应激、炎性因子、内皮素-1、一氧化氮、转化生长因子-β1(transformingfactor beta-1，TGF-β1)、结缔组织生长因子等有关。　　 肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensirn-aldosterone system，RAAS)在心肌纤维化过程中扮演了关键角色，该系统的激活可使循环和心肌局部的血管紧张素Ⅱ(angiotensionⅡ，AngⅡ)浓度增加，进而通过释放、激活一系列细胞因子如TGF-β1，可诱导心脏成纤维细胞向肌纤维母细胞分化，还可以激活心肌成纤维细胞，合成量的胶原、纤维连接素、层粘蛋白等，引起细胞外基质的大量增生和过度积聚，导致心肌纤维化。　　 研究表明TGF-β1在心肌纤维化的过程中起重要作用，且可能是诸多因素导致心肌纤维化最后的共同中介物之一。TGF-β1是成纤维细胞的强趋化因子，诱导其分化为心肌成纤维细胞，刺激胶原蛋白、纤维连接蛋白及蛋白多糖等细胞间质成分的合成，促进细胞间质的沉积。目前认为，TGF-β1/Smads信号转导通路是TGF-β1发挥生物学作用的主要通路，其分子组成与分子调节复杂，对心肌纤维化的发生和发展有明确的作用。　　 针对心肌纤维化的发病机制，目前用于防治心肌纤维化的药物主要有血管紧张素转换酶抑制剂、AngⅡ受体阻断剂、醛固酮拮抗剂、β受体阻滞剂、钙拮抗剂、他汀类、基质金属蛋白酶抑制剂、内皮素受体阻断剂、羟氨酰羟化酶抑制剂等。但由于西药的不良反应、价格昂贵以及一些药物尚处于试用阶段而限制了其临床应用。　　 中医中药作为我国医学的瑰宝，在心肌纤维化方面的研究逐渐增多。四逆汤出自《伤寒论》，由干姜、附子、甘草组成，早被证实具有防治心力衰竭作用。现代研究证实四逆汤具有抗氧化应激、保护血管内皮细胞功能、改善冠脉循环、抑制RAAS系统和TGF-β1、调节炎症因子、逆转左心室肥厚等作用。由此，我们推测四逆汤对心肌纤维化的防治可能也具有重要的作用。　　 研究目的：　　 本课题的目的是通过皮下注射异丙肾上腺素诱导大鼠心肌纤维化，观察中药四逆汤对异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌纤维化的保护作用，以及对AngⅡ、TGFβ1/Smads的影响，探讨四逆汤对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌纤维化的防治作用及可能机制，为四逆汤用于临床防治心肌纤维化提供理论依据。　　 材料与方法：　　 19只雄性Wistar大鼠随机分为对照组(5只)、异丙肾上腺素组(6只)和四逆汤组(8只)。异丙肾上腺素组及四逆汤组均给予皮下注射异丙肾上腺素，对照组注射生理盐水，连续8天，自由进食。第9天开始，四逆汤组给予四逆汤灌胃，对照组和异丙肾上腺素组均给予生理盐水灌胃。4周后，各组用导管法测定左室心功能后处死大鼠。留取大鼠血浆，用放免法测定血浆AngⅡ水平；用Elisa法检测血浆TGF-β1水平；留取部分大鼠心肌，行Masson染色观察心肌胶原增生情况，透射电镜观察心肌的超微结构变化；留取部分大鼠心肌，检测心肌羟脯氨酸水平；通过免疫组化方法检测心肌TGF-β1蛋白的表达；RT-PCR法检测TGF-β1 mRNA表达。　　 结果：　　 1.扫描电镜结果　　 对照组(Control)：心肌细胞结构正常，肌节排列整齐，肌膜及细胞器完整，闰盘、Z线清楚，无胶原纤维增生；异丙肾上腺素组(Iso)：心肌细胞肿胀，肌丝H线不清晰，甚至溶解消失，线粒体有的呈巨型，可见肿胀，嵴模糊，甚至消失；胶原纤维增多，间隙增粗，排列紊乱，并有水肿、撕裂，成纤维细胞数目增多，功能亢进(胞浆增多)；四逆汤组(Iso+SD)：心肌细胞肌节排列整齐，肌丝轻度溶解，线粒体轻度模糊，胶原纤维增生明显减少，排列整齐，成纤维细胞密度未见增加，胞浆少，功能未见亢进。　　 2.病理结果(Masson染色)　　 对照组：大鼠心肌细胞排列紧密，整齐，呈鲜红色，间质中基本上没有心肌损伤及成纤维细胞增生；异丙肾上腺素组：心肌内层及间质中可见多处大面积的块状瘢痕组织，为心肌坏死后成纤维细胞增生机化；四逆汤组：可见点、片状染成绿色的胶原纤维，心肌纤维细胞的增生明显少于异丙肾上腺素组。　　 3.血流动力学检查　　 异丙肾上腺素组左室舒张末压(LVEDP)比四逆汤组及对照组明显增加(P＜0.05)，而四逆汤组与对照组比较无明显差异(P＞0.05)；异丙肾上腺素组左室末最大下降速率(-dp/dtmax)比四逆汤组及对照组明显减小(P＜0.05)，而四逆汤组与对照组无明显差异(P＞0.05)。　　 4.心肌羟脯氨酸含量　　 实验结果发现异丙肾上腺素组心肌羟脯氨酸浓度明显高于对照组和四逆汤组，经过四逆汤治疗后，四逆汤组心肌羟脯氨酸水平明显低于模型组(P＜0.05)，而四逆汤组羟脯氨酸水平明显高于对照组(P＜0.05)。　　 5.四逆汤对大鼠血浆AngⅡ含量的影响　　 异丙肾上腺素组大鼠血浆AngⅡ显著高于对照组(P＜0.05)；治疗后，四逆汤组AngⅡ含量显著低于异丙肾上腺素组(P＜0.05)，与对照组无明显差异(P＞0.05)。　　 6.四逆汤对大鼠血浆TGF-β1的影响　　 异丙肾上腺素组血浆TGF-β1含量明显高于四逆汤组及对照组(P＜0.05)，而四逆汤组与对照组无明显差异(P＞0.05)。　　 7.四逆汤对心肌TGF-β1、Smad2、Smd7蛋白表达的影响　　 免疫组化发现3组细胞内胞浆有染色为棕褐色的TGF-β1、Smd2和Smad7蛋白表达，异丙肾上腺素组TGF-β1、Smad2蛋白表达明显高于对照组，Smad7蛋白表达明显低于对照组(P＜0.05)，四逆汤组TGF-β1、Smad2蛋白表达明显低于异丙肾上腺素组，Smad7蛋白表达明显高于异丙肾上腺素组(P＜0.05)。　　 8.四逆汤对心肌TGF-β1、Smad2和Smad7 mRNA表达的影响　　 RT-PCR结果发现，3组大鼠心肌均有465 kb Smad2、304 kb Smad7和290kbTGF-β1 DNA扩增产物，异丙肾上腺素组Smad2、TGF-β1 DNA产物明显多于对照组，四逆汤组明显少于异丙肾上腺素组(P＜0.05)；异丙肾上腺素组Smad7 DNA产物明显少于四逆汤组和对照组(P＜0.05)，而四逆汤组与对照组无明显差异(P＞0.05)。作为对照GAPDH为260 kb大小的产物，各组无显著差异。通过图像分析系统对RT-PCR结果进行处理，以Smad2、Smad7和TGF-β1的吸光度与对照GAPDH(TGF-β1/GAPDH)的比值反映mRNA表达的改变，异丙肾上腺素组Smad2/GAPDH、TGF-β1/GAPDH的吸光度比值明显强于对照组和四逆汤组(P＜0.05)，而后两组之间无显著性差异；异丙肾上腺素组Smad7/GAPDH的吸光度比值明显低于对照组和四逆汤组(P＜0.05)，四逆汤与对照组无明显差异(P＞0.05)。　　 结论：　　 1.连续皮下注射异丙肾上腺素可成功诱导大鼠心肌纤维化，并出现心脏舒张功能障碍。　　 2.四逆汤可减轻异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌纤维化，并可改善异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌纤维化后心脏舒张功能障碍。　　 3.四逆汤可抑制异丙肾上腺素诱导大鼠心肌纤维化后的RAAS系统活性，减少AngⅡ生成。　　 4.四逆汤可调节异丙肾上腺素诱导大鼠心肌纤维化的TGF-β/Smads信号转导通路的蛋白和基因的表达，减少TGF-β、Smad2的产生，增加Smad7的产生。