论文部分内容阅读
细胞间粘附分子1 (intercellular adhesion molecule-1 ICAM-1)是一种细胞表面单链糖蛋白,参与抗原识别、补体结合、细胞粘附功能。可溶性细胞间粘附分子1 (soluble intercellular adhesion molecule-1 sICAM-1)为细胞表面ICAM-1脱落所形成,其表达是导致Graves’病发生的重要因素之一,并且其血清水平对于判断Graves’病的停药和复发具有重要意义。利用纯品ICAM-1免疫小鼠制备得到抗ICAM-1的单克隆抗体,为进一步治疗Graves’病奠定了基础,将会有一定的经济意义和临床应用前景。目的：1.利用纯品ICAM-1免疫小鼠制备得到具有生物活性的抗ICAM-1的单克隆抗体。2.利用抗ICAM-1的单克隆抗体,治疗Graves’病模型小鼠。方法：1.用纯品ICAM-1来免疫动物。将纯品ICAM-1蛋白与佐剂混合腹腔注射BALB/C小鼠三次,每次间隔大约3周,取小鼠内眦静脉血测免疫效价,取效价高的小鼠尾静脉注射加强免疫一次,三天后取小鼠脾细胞,与骨髓瘤细胞以5：1的数量混合,在PEG(polyethylene glycol,聚乙二醇)作用下进行细胞融合。一周后取细胞生长孔上清经ELISA检测抗体分泌情况,将阳性分泌孔扩大培养并进行亚克隆。三次亚克隆后,将单克隆孔细胞扩大培养,进行杂交瘤细胞及单克隆抗体的鉴定,同时采用动物体内诱生的方法大量制备单克隆抗体。最后用Protein G SepharoseTM 4 Fast Flow(简称protein G)纯化腹水得到抗ICAM-1的单克隆抗体。2.腹腔注射抗ICAM-1的单克隆抗体治疗Graves’病模型小鼠：6只,10ug/只,一共注射3次,每次间隔24小时,3天后检测,比较治疗前后小鼠血清T4和TRAb(以刺激性抗体TSAb为主)含量的变化,评价治疗效果。结果：1.利用纯品ICAM-1免疫小鼠三次,经三次基础免疫后小鼠血清中的抗体效价可达到1：10000。融合后一周左右,杂交瘤细胞可生长至1/3-1/2培养孔面积时,取上清液经ELISA检测抗体分泌情况,筛选出4个阳性孔,阳性OD405值均约2.0。将阳性孔扩大培养后进行三次亚克隆化,获得单克隆,扩大培养后进行杂交瘤细胞及单克隆抗体的鉴定。杂交瘤细胞染色体分析发现染色体数目众数为98-104。数目上接近两种亲代细胞染色体数目的总和,结构上多数为端着丝点染色体,还有少数亚中部着丝点染色体。4株细胞分泌的单克隆抗体的免疫球蛋白类别均为IgG1型。动物体内诱生的腹水中抗体效价均可达1:200000, Protein G纯化腹水上清效价均可达1：200000,纯化后的单抗蛋白浓度为1.2 mg/ml,并均可与ICAM-1特异性结合。2.利用抗ICAM-1的单克隆抗体治疗Graves’病模型小鼠6只,比较治疗前后小鼠血清：1)T4治疗前为36.63±3.64,治疗后为20.12±2.15,两者比较为t=7.945,p=0.001,差别具有统计学意义；2)TRAb以刺激性抗体TSAb为主,治疗前为2.02±0.27,治疗后为0.54±0.14,两者比较为t=11.388,p=0,差别具有统计学意义。结论：1.成功地制备出4株抗ICAM-1的单克隆抗体,分别为：B9,F1,C11,D6.2利用抗ICAM-1的单克隆抗体治疗Graves’病模型小鼠,有一定的治疗效果,为进一步的研究奠定了基础。