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克伦特罗（Clenbuterol,CL）是一种常被非法用作促生长添加剂的β2-受体激动剂,彻底查禁CL的非法滥用,必须要有高效、灵敏、特异的残留检测方法。本研究利用偶氮化法制备出克伦特罗人工抗原,用杂交瘤技术研制出克伦特罗特异性单克隆抗体并将之作为检测试剂建立克伦特罗固相抗体竞争ELISA残留检测方法,试验结果如下: 在阴暗避光4℃的条件下,用亚硝酸钠使CL发生偶氮化反应,偶氮化CL与载体蛋白酪氨酸残基上的酚羟基反应,从而生成“CL-载体蛋白”偶联物。分别制备出CL-KLH、CL-BSA和CL-OVA三种偶联物,CL-BSA经过200nm～360nm波长紫外扫描,BSA在279nm波长吸收最大,最大吸收波长A值为0.0381,此时CL-BSA的A值为0.1501,CL的A值为0.2502。在CL-BSA溶液中蛋白质的浓度与BSA溶液相同的条件下,CL-BSA的A值明显比BSA的高。初步说明CL与BSA已偶联形成CL-BSA。经SDS-PAGE电泳CL-BSA比BSA分子量增加,进一步说明CL分子与BSA分子结合了。用CL-KLH与CL-BSA分别免疫小鼠制备抗血清,用CL-OVA包被酶标板,检测到的抗体可以和游离的CL发生特异性的结合反应。 用CL-KLH免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合与克隆筛选出4株稳定分泌CL抗体的杂交瘤细胞株1D6、1H5、1H7和2F10,用间接ELISA方法测得四株杂交瘤培养上清液效价分别达到1:1100、1:1200、1:900和1:700,四株腹水单抗的效价介于1:3.6×104～1:3.2×105之间。对CL亲和力从强至弱依次为1D6>1H5>1H7>2F10。单抗1D6、1H5、1H7和2F10都属于IgGl亚类抗体。对沙丁胺醇交叉反应性测定,结果最小的是1D6,只有3.98%的交叉反应性。1H5、1H7和2F10交叉反应性依次为12.9%、26%和<5%。抗原识别位点分析结果表明,这四株McAb至少识别两个不同的抗原位点。 在单抗腹水纯化的基础之上,将兔IgG与CL偶联得到兔IgG-CL偶联物,作为桥梁,与样品中的游离的CL竞争,建立了竞争ELISA方法,并对各实验参数进行优化,筛选出试验最佳反应体系:纯化单抗最佳包被浓度是5ug/ml,4℃作用24h;兔IgG-CL偶联物最佳工作摩尔比1:128,最佳工作浓度8ug/ml,37℃作用1h;羊抗兔酶标二抗的最佳稀释浓度1:5000,37℃作用1h;底物溶液（TMB+H2O2）37℃作用15min。通过对已知标准液样品的检测绘制出标准曲线,并且通过重复对已知标准液样品的检测结果表明:不同板间F=0.833,