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粮食的增产方向有种质资源的发掘、新的基因和杂种优势的利用。水稻的自花授粉给水稻杂交带来了难题,而水稻雄性不育很好地解决了这个问题。两系法很好地利用了杂种优势,它的优点在于:一、一系两用。二、充分利用遗传资源,更易于筛选出优势组合。三、不育性状易于转育。四、核不育系简化了繁殖程序。湖北大学遗传学研究室的HD9802S为本研究中所用到的温敏核不育系,其不育基因在之前的研究中被命名为HDtms。本研究采用两种不同的方法对不育基因HDtms进行定位:第一种方法是以HD9802S/(HD9802S/R287)BC1群体为材料结合SSR标记法进行遗传图谱的构建,并且筛选出与不育基因紧密连锁可以运用于分子标记辅助选择的SSR标记。第二种方法是以HD9802S/R287F2群体为材料结合BSA重测序法,对候选区间内可以引起功能突变的SNP或者InDel进行筛选与分析。具体的研究结果有以下几点:1、对HD9802S/(HD9802S/R287)BC1群体进行花粉育性鉴定,采用了两种标准划分不育株与可育株,经卡方检验,不育株与可育株的分离均符合1:l的理论比例,表明HD9802S的不育性由一对主效隐性核基因控制。发现每个花粉可染率区间均有不同比例的植株分布,所以认为HD9802S的不育性存在微效基因的修饰作用。2、从农业部水稻品种鉴定推荐的48个位点的SSR标记中筛选分布在水稻12条染色体上且在不育系HD9802S和恢复系R287之间有多态性的标记,筛选得到15个标记,覆盖1、4、5、6、7、10、11、12号染色体。之后从RAP数据库(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html)和 GRAMENE 数据库(http://www.gramene.org/)补充了 7个SSR标记,使SSR标记涵盖水稻12条染色体长臂和短臂。从HD9802S/(HD9802S/R287)BC1群体中随机选取64个样品(32个样品为高度不育株;32个样品为高度可育株)的DNA作为模板进行PCR扩增,统计四种带型(高度不育株亲本带,高度不育株重组带,高度可育株亲本带,高度可育株重组带)的数量和比例。第二号染色体上的两个标记(RM5897和RM1358)对应四种带型的比例不符合1:1:1:1的自由组合定律,经卡方检测差异极显著,P值分别对应为6.683×10-9、1.118×10-8,表明HDtms位于第二号染色体上。将HDtms作为目标基因标记,对应64个单株的带型按编号一一录入软件QTL IciMapping 3.0进行分群,HDotms被划分到第二号染色体上,与上述结果一致。3、在第二号染色体上每隔10 cM筛选一个在HD9802S和R287之间存在多态性的SSR 标记,最终得到 RM279、RM12601、RM12631、RM12694、RM5897、RM12783、RM71、RM1358、RM1313、RM5707。利用 HD9802S/(HD9802S/R287)BC1群体 428个合格样品的DNA作为模板,用这10个SSR标记进行遗传图谱的构建,图谱全长112.21 cM,平均图距为11.22 cM,HDtms在标记RM5897与RM12783之间。4、确定了HDtms基因在RM5897与RM12783之间后,在此区间每隔5cM筛选一个SSR标记进行两亲本间多态性的鉴定,进一步筛选与HDtms连锁紧密的标记,得到RM12747在HD9802S和R287之间存在多态性,且对BC1群体428个单株中不育性状的筛选率最高,为90.135%,可初步作为应用于分子辅助选择的SSR标记。5、构建HD9802S/R287F2群体,将F2群体中不育株抽提DNA,等量混合构建50、100、150个样品的不育基因池,进行BSA基因组重测序。突变体位点筛选的步骤为(1)挑选野生亲本、突变亲本、子代突变混池中测序深度大于等于5且小于等于样本的变异位点;(2)挑选野生亲本和突变亲本中纯合且不一致位点(index>=0.8);(3)挑选突变混池中纯合且和突变亲本一致位点(index>=0.8)。则样品数为50、100、150混池的SNP 与 InDel 数目分别为 72634、1940;63965、1564;62948、1564。样品数为 100 的混池相对于样品数为50混池的SNP数目减少了约12%,InDel数目减少了约20%;相对于样品数为150混池的SNP与InDel数目变化不大。则在BSA重测序时混池数目为100得到的结果足够精确,不仅能降低背景噪音还节约成本。本研究仍然以样品数为150混池的结果来进行分析:通过筛选SNP-index>0.8的位点,发现在水稻第二号染色体6-7.5 Mb处有峰值,即SNP候选区间。在此SNP候选区间可以引起功能改变的SNP数目为173,InDel数目为2,包含基因BGIOSGA006970至BGIOSGA007791共36个注释基因。其中有10个基因功能目前并未研究,26个已研究的基因中,BGIOSGA007782编码一种RNAseZ,同时也是安农S-1的不育基因tms5,则HDtms与tms5极可能是同一个基因。6、位于第四号染色体上的SNP对应的基因可能影响HD9802S的育性。HD9802S的转育起点温度较低,而微效基因影响温敏不育系水稻转育温度。第四号染色体上SNP-Index>0.8的SNP位点的峰值区间为15.78-18.93 Mb。此区间内可以引起功能改变的SNP数目为33,InDel数目为1,包含基因BGIOSGA015234至BGIOSGA016370共20个注释基因,其中11个基因的功能目前并未研究。这些基因是否与HD9802S转育起点温度有联系将在进一步研究中探究。