研究背景:目前,随着人类社会的变化,恶性肿瘤的发病率日趋增加,尤其是胆道系统中的胆囊癌,对人类身体健康构成了非常大的威胁。随着近现代医学技术的不断发展,对胆囊癌症疾病的发病有了全新的认知,在早期诊断方面更及时化、规范化,为患者良好治疗及预后提供了重要的指导意义。相关的研究结果显示,在人类的调节基因中,miRNAs调节占比大约60%,其中主要的因子包括:原癌原因、肿瘤抑制因子等。上述比例,充分展示了 miRNAs和肿瘤之间的相关性。目前,微小RNA(miRNA)作为调节生物体中许多关键基因表达的基因研究越来越深入。miRNA是一种非编码单链RNA,包含20-25个核苷酸,它们通过与靶向mRNA的3’-非编码区结合,再转录,调节基因表达。在细胞中,RNA-poly II将miRNA转录成初级miRNA转录物,然后转运到细胞核中,由Drosha酶生成miRNA前体,其、后者在细胞质中被加工成成熟的miRNA。miRNA可发挥多种生理功能,可以调节细胞发育,增殖和分化,细胞凋亡,参与各种免疫应答,炎症过程,也可参与一些自身免疫系统疾病和某些癌症基因的表达。此外,在很多临床标本和癌症组织中MiRNA能够保持长期的稳定性,所以miRNA可以用作某些癌症预后的生物学标志物。miR-155位于人类第21号染色体的非编码转录区第3个外显子内,由RNA聚合酶(RNA-polymerase)转录成前体 miRNA(pre-cursor miRNA,pre-miRNA),后者具有聚腺苷酸尾和帽结构的短发夹样结构。细胞核中,Drosha复合酶将其进一步改造,使其转化为60至70nt大小的核苷酸,然后在细胞质中由DNA切割酶活化,最后产生约21-25nt大小的短miRNA。miRNA-155具有多种生物学功能,其主要功能主要体现在基因转录后和翻译前调节,进而影响各种大分子物质的表达。在一般情况下,成熟miRNA-155在T细胞和B细胞中表达,其它参与表达的还有单核细胞和巨噬细胞等。后来,越来越多的研究证实miRNA-155的表达异常与许多疾病如癌症,心血管疾病,炎症,自身免疫疾病等相关。研究发现,在乳腺癌、白血病、甲状腺癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌和肾细胞癌等各类型的肿瘤中,miR-155均在此类恶性疾病的过度表达。以前,Kono等学者也提出了在胆囊癌中,miR-155有过度表达。在胆囊癌的发展过程中,miR-155体现出来的表达水平,与患者的淋巴转移,以及预后情况,均显示了二者之间明显的相关性。另外,有相关的试验证明,miR-155的异常表达,也明显增强了胆囊癌细胞的侵袭性。然而,miR-155在中国人群胆囊癌中的临床意义还没有研究过。目前,关于胆囊癌的发病机制却未明确,治疗的手段也比较单一,大多都是以手术切除的方式为主。但是,由于发病症状并不明显,临床症状也非常隐秘,因此,此类疾病的初期诊断率并不高。临床上80%以上的患者在明确诊断时已属中晚期,然而在大部分患者通过采取手术治疗后,效果并不佳,甚至术后的复发率高达50%。由此可见,对于胆囊癌的化疗手段显得非常十分重要。本研究将在已有的研究基础上,从细胞和机体两个水平探究在胆囊癌患者中,miRNA-155的表达水平对索拉非尼化疗效果的影响。目的:采用荧光定量逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription-PolymeRase Chain Reac-tion,RT-PCR)的方法,测定人胆囊癌组织及正常的胆囊组织中miR-155的表达。观察miR-155有无异常表达及其在人胆囊癌诊断与治疗中的临床意义。(2)研究索拉非尼对人胆囊癌GBC-SD细胞和胆囊癌患者的作用以及与miRNA-155表达的关系。方法:(1)选取我院2008年5月至2014年4月间行胆囊癌手术治疗的病人,术前均未经放疗及化疗,术后通过RT-PCR法测定胆囊癌组织和正常胆囊组织miR-155的表达。梅耶生存曲线(Kaplan-Meier)法,分析患者术后5年生存率。(2)索拉非尼处理GBC-SD细胞:分为正常细胞对照组、GBC-SD细胞组和不同剂量索拉非尼处理组(剂量分别为3、6和12 μmol/l)。采用RT-PCR法测定相应细胞中miR-155的表达水平;采用四氮唑盐还原(MTT)法检测细胞活性;采用流式细胞仪检测GBC-SD细胞的凋亡情况。(3)选取本院收治的26例接受索拉非尼化疗的胆囊癌患者,术后取癌组织及癌旁组织检测miR-155表达,分析miR-155的表达水平变化及其与患者预后的相关性。结果:(1)miR-155在胆囊癌组织和正常胆囊组织中的表达:133例胆囊癌组织中miR-155的表达水平,均明显高于正常胆囊组织,差异具有统计学意义(P<0.01)。miR-155表达水平与临床病理特征:miR-155高表达与TNM分期(P = 0.003),淋巴结转移(P = 0.042),肝脏转移(P = 0.010),以及分化程度(P<0.001)等密切相关。miR-155表达和其他临床病理因素,包括性别,年龄(所有P>0.05,表1示)之间没有显著关联。miR-155表达与患者的生存相关性:与miR-155低表达的患者比,miR-155高表达的胆囊癌患者,其总体生存期明显更长,差异具有统计学意义(P= 0.03)。另外胆囊癌患者术后总生存期的影响因素很多,多因素分析发现,miR-155表达水平高低可以作为其独立预后因素之一。(HR=2.394,95%CI:1.568-10.034;P = 0.009)。(2)索拉非尼对人胆囊癌GBC-SD细胞活性的影响:MTT检测结果显示,不同浓度(3、6和12μmol/l))索拉非尼处理GBC-SD细胞不同时间(24、48和72h)后,GBC-SD细胞活性均受到不同程度的抑制,其抑制作用随作用浓度和时间的增加而增强,其中以12 μmol/L作用72h时,抑制率为79.96±7.53%,抑制作用最强。(3)索拉非尼对人胆囊癌细胞凋亡的影响:流式细胞仪分析索拉非尼对GBC-SD细胞凋亡的影响,在不同剂量的索拉非尼处理下,GBC-SD细胞的凋亡率变化明显,在3、6和12 μmol/1的索拉非尼处理组中,GBC-SD细胞的凋亡率依次是17.46±2.1%、28.64±4.9%和57.47±8.03%,与对照组相比,各个剂量索拉非尼处理组GBC-SD细胞的凋亡率差异均具有统计学意义(P<0.05或P<O.01),而且表达出与剂量的相关性。(4)索拉非尼对人胆囊癌细胞GBC-SD miR-155表达的影响:在正常胆囊细胞中miR-155表达较低,而在GBC-SD细胞中miR155的表达显著上调(P<0.01);与正常对照组相比,GBC-SD细胞经索拉非尼处理后,miR-155的表达又显著下降(P<0.01),且表现出一定的量效关系。尤其是在12μmol/L的索拉非尼处理下,miR-155的表达水平和正常对照组差异没有统计学意义(P>0.05)。(5)索拉非尼对人胆囊癌患者miR-155表达的影响:在胆囊癌组织中,miR-155表达水平显著高于癌旁正常组织(P<0.01)。当患者接受索拉非尼化疗后,患者胆囊癌组织中miR-155表达显著下降,与胆囊癌组比差异具有统计学意义、(P<0.01)。(6)索拉非尼对人胆囊癌患者预后的影响:随访发现,患者术后生存时间与TNM分期、淋巴结转移、分化程度以及miR-155表达水平有关。Ⅰ/Ⅱ和Ⅲ/Ⅳ期胆囊癌患者经索拉非尼化疗后,平均生存时间分别为46.4±8.9和18.5±2.4月,两组患者生存时间之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。有无淋巴结转移及肿瘤分化程度高、低的患者生存时间也具有统计学差异(P<0.05)。尤其在miR-155高表达和低表达的患者中,索拉非尼化疗后生存时间分别是19.4±3.9月和37.6±4.0月,两者之间的差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:(1)miR-155在胆囊癌组织中表达水平显著高于正常胆囊组织,其高表达与TNM分期、分化程度及肝脏转移、淋巴结转移等密切相关,且miR-155高表达的胆囊癌患者总体生存期明显低于miR-155低表达的患者,提示miR-155高表达可作为中国人群中胆囊癌患者预后不良的一个指标。(2)不同浓度索拉非尼处理GBC-SD细胞后GBC-SD细胞活性均受到不同程度的抑制,细胞的凋亡率明显上升。使用索拉非尼化疗的胆囊癌患者平均生存时间延长,提示使用索拉非尼化疗后GBC-SD细胞miR-155表达水平的下降与其化疗效果和患者的预后生存密切相关。(3)索拉非尼可能通过下调miR-155表达抑制GBC-SD细胞的活性、促进GBC-SD细胞凋亡。