胞嘧啶,学名4-氨基-2-羟基嘧啶,是生物体内合成DNA和RNA的重要嘧啶类碱基,在精细化工和生物医药领域应用较为广泛。目前,胞嘧啶主要通过有机化学合成法获得。该方法存在成本高、得率低、污染环境等缺点,不利于扩大生产。随着生物学的发展,微生物发酵法因其生产效率高、环境友好、原料低价易得等优点逐渐成为研究胞嘧啶的理想生产方法。本研究以实验室尿苷工程菌和公司提供的胞苷生产菌为出发菌分别利用基因组编辑技术和外源质粒表达构建了大肠杆菌胞嘧啶生产菌株。本研究以尿苷工程菌Escherichia coli U0为出发菌,通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术重构菌株胞嘧啶合成途径。第一步,敲除了胞嘧啶脱氨酶基因cod A和胞嘧啶渗透酶基因cod B,阻断胞嘧啶向尿嘧啶的转化,同时减少胞嘧啶向细胞内的转运。第二步,整合了嘧啶单磷酸核苷酶基因ygd H,由噬菌体来源的T7启动子控制转录,加强胞苷酸（CMP）到胞嘧啶的水解反应,构建了菌株E.coli C3。摇瓶发酵结果显示,胞嘧啶产量为0.86 g/L,尿苷产量为4.82 g/L,比出发菌降低了3.98%。副产物尿嘧啶为0.97 g/L,比出发菌降低了37.41%,菌株生物量(OD600)没有明显变化。以上结果表明,阻断胞嘧啶降解同时强化CMP到胞嘧啶的代谢途径有利于胞嘧啶的初步积累。为了进一步提高胞嘧啶产量,本研究强化了尿苷酸（UMP）到CMP的关键代谢反应。在菌株E.coli C3基础上整合了核苷三磷酸焦磷酸水解酶基因nud G,强化胞苷三磷酸（CTP）到CMP的水解反应;整合了携带突变点的大肠杆菌内源尿苷酸激酶基因pyr H（D93A）,强化UMP向尿苷二磷酸（UDP）的转化;整合了携带突变点的大肠杆菌内源胞苷三磷酸合酶基因pyr G（E155K）,强化尿苷三磷酸（UTP）向CTP的转化,构建了菌株E.coli C6。发酵结果显示,E.coli C6胞嘧啶产量为1.34 g/L,比E.coli C3菌增长了55.81%;尿苷产量为3.70 g/L,比出发菌降低了26.29%;副产物尿嘧啶产量为0.73 g/L,比出发菌降低了52.90%。这表明增强关键酶的表达量,解除反馈抑制有利于胞嘧啶的进一步积累。为了减少尿苷和尿嘧啶的量,本研究在E.coli C6菌株基础上依次敲除了四种核苷酸水解酶基因:ush A、sur E、yjj G和yrf G,构建了菌株E.coli C7-E.coli C10。发酵结果显示,随着水解酶基因的敲除,胞嘧啶产量逐步提高。水解酶基因全部敲除的菌株E.coli C10胞嘧啶产量为1.95 g/L,相比较于E.coli C6菌株提高了53.54%;尿苷产量为2.89 g/L,相比较于E.coli C6菌株下降了25.52%;副产物尿嘧啶产量为0.51 g/L,相比较于E.coli C6菌株降低了37.80%。这表明水解酶的敲除在一定程度上可以减弱UMP向尿苷的代谢,从而减少副产物尿苷的产生。本研究以公司胞苷生产菌Escherichia coli B0为出发菌,利用同源重组的方法构建含有不同核苷水解酶基因rih A、rih B、rih C的外源重组质粒,将重组质粒与原质粒导入胞苷生产菌E.coli B0,构建了菌株E.coli B1、E.coli B2、E.coli B3、E.coli B4。发酵结果显示,相比较于E.coli B1菌株和E.coli B3菌株,E.coli B2菌株的胞嘧啶产量最高,为1.97 g/L,副产物尿嘧啶产量最少,为0.48 g/L。从产量来看,rih B基因编码的特异性水解酶更倾向于对胞苷的水解。与出发菌E.coli B0相比,新构建菌株菌体量都大幅下降,这表明质粒的存在给菌株生长带来一定负担。为了降低菌株生长压力提高菌体量,本研究选取低拷贝质粒p S-74与水解酶基因rih B连接重新导入胞苷生产菌,构建了菌株E.coli B5。摇瓶发酵结果显示,B5菌株胞嘧啶产量为3.25 g/L,相比较于B2菌株提高了64.14%。副产物尿嘧啶为0.57 g/L,与B2菌株相近。菌体量相比较于B2菌株提高了23.23%。这表明将高拷贝质粒换成低拷贝数质粒,能够有效降低质粒对菌株生长的影响,保证菌体生长的同时也增加了胞嘧啶的合成效率。B5与B2菌株进行5 L发酵罐发酵,B5菌株产生的胞嘧啶为45.80 g/L,比B2菌株提高了40.84,菌体生物量提高了20.72%。综上,选择对胞苷特异性更好的核苷水解酶和适宜拷贝数的质粒对胞嘧啶的积累能够起到积极的作用。本研究构建的胞嘧啶生产菌株能够通过微生物发酵法实现胞嘧啶的积累,与有机合成法相比,具有很好的工业化应用前景。