丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)在1989年即已分离获得,但由于HCV很难在体外培养且在血中滴度很低,一直阻碍了HCV的研究和抗病毒药物的开发,因此HCV体外培养细胞模型和小动物模型的建立是HCV研究的关键问题之一。基于HCV 2a型JFH1株的细胞模型的建立解决了部分难题。JFHI株是由Kato等于2001年从日本1例暴发性丙型肝炎患者体内获得的,其基因型为2a,JFH1能在体外高效复制并产生感染性的病毒颗粒。但迄今为止,无需突变即能在体外高效复制并产生感染性病毒颗粒的仅限于JFH1株,而JFH1株不能完全代表其他主要基因型的流行特征。因此建立能够支持其他基因型尤其是我国最主要的基因型1b型复制的细胞培养系统成是当前HCV研究的迫切任务。自1999年复制子模型系统被首次描述以来,人们通过对复制子的研究发现,NS5A蛋白是参与HCV复制的重要因子,NS5A通过与其他复制蛋白作用后,形成一个激活的复制复合体,起始HCV在体内的复制。复制子的非结构基因在体外细胞培养中会发生适应性突变(adaptive mutation),将适应性突变预先引入复制子中能够提高克隆形成率(efficiency of colony formation,ECF),适应性突变一般出现在NS3、NS4B和NS5A区,部分突变位点之间有协同效应,其中NS5A的适应性突变导致高度磷酸化的NS5A蛋白形式(p58)下调,从而促进亚基因组或全基因组的复制;或者是突变后与其他的复制阻遏蛋白的结合变弱,促进复制复合体的形成,从而也促进复制子的复制。HCV core蛋白的氨基酸序列十分保守,在各型中的同源性达到95%。Core蛋白在包裹病毒RNA,维持其固有的外在形态和病毒所致持续感染中发挥关键作用。HCV的结构基因和非结构基因产物之间的相互作用对细胞培养中产生的HCV感染性颗粒是至关重要的。Core蛋白在HCV的感染颗粒包装和产生中起重要作用。已有研究表明,HCV在core蛋白表达受阻的情况下,其病毒的复制会在一定程度受到抑制,但对于core蛋白具体的作用机制,目前相关的研究还很少。病毒入侵感染的首要步骤是与宿主细胞膜上的相应受体结合,形成一个配体-受体复合物。HCV结构蛋白中包膜蛋白E,就是这样一种受体结合蛋白,以E1/E2二聚体的形式,与宿主细胞膜上的CD81,SR- BI,claudin1,occludin等分子结合后,以复合体的形式介导HCV的入侵。乙型脑炎病毒(JEV)和HCV都属于黄热病毒,基因结构非常相似,均为单股正链RNA病毒。JEV结构蛋白中的囊膜糖蛋白E,也是介导HCV入侵细胞的关键分子。JEV不仅能感染人,也能感染小鼠。已有报道,HCV的JFH1株,能在小鼠细胞内复制,但是不能包装出具感染性病毒颗粒。因此,在本研究中我们用基因置换的方法研究NS5A、C以及E区置换对HCV复制和感染的影响,以期为建立1b基因型的细胞培养模型以及小动物模型建立基础。本研究首先比较J4NS5A基因置换FL-J6JFH1相应区域后构建的嵌合子FL-J6JFH/J4NS5A与野生型FL-J6JFH1复制和感染的差别。接着用人工定点突变的方法对嵌合子NS5A的三个复制相关位点氨基酸改变(S2197P,S2201del,S2197P+S2201del,S2197P+S2204I),比较突变前后复制能力的差别。同时用基因置换的方法用J4 core平行置换FL-J6JFH1构建嵌合复制子FL-J6JFH/J4core,比较置换前后复制能力的差别。此外,本研究还用同属黄热病毒的乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的E区基因置换HCV的相应区域,构建了HCV/JEV嵌合复制子,比较HCV细胞亲嗜性的改变,以期建立跨种感染的HCV细胞模型。一、JFH1 NS5A基因置换对FL-J6JFH1复制和感染的影响以我国HCV最主要基因型(1b型J4株)的NS5A替换FL-J6JFH的相应基因得到嵌合型FL-J6JFH/J4NS5A,与野生型FL-J6JFH1,以及复制缺陷型阴性对照FL-J6JFH(GND)线性化后体外转录成RNA,用脂质体分别转染Huh-7.5.1细胞。比较三者转染细胞在培养过程中HCV RNA水平差异。转染后第5,8,12天抽提细胞总RNA,逆转录成cDNA后作为模板,以HCV特异的荧光定量PCR(FQ RT-PCR)检测细胞内HCV的RNA水平。结果显示,在检测的三个时间点上嵌合体转染细胞内HCV RNA水平一直低于野生型转染的细胞。在第5天,FL-J6JFH转染细胞内HCV RNA为1.1×106 GE/μg RNA,第8天,下降到9.5×105 GE/μg RNA,此后RNA水平明显上升,第12天上升到4.6×106 GE/μg RNA。而嵌合体FL-J6JFH/J4NS5A的HCV RNA水平则维持在一个较低且稳定的水平(104 GE/μg RNA以上)。阴性对照FL-J6JFH(GND)转染细胞后HCV RNA很快被宿主细胞清除。以丙型肝炎患者血清为一抗,免疫荧光检测转染细胞内HCV蛋白的表达,在第3、5、8和12天FL-J6JFH1和FL-J6JFH/J4NS5A转染的细胞内都可以检测到HCV蛋白表达,FL-J6JFH/J4NS5A转染细胞的荧光强度要显著低于野生型FL-J6JFH转染细胞,而对照的FL-J6JFH(GND)转染则没有检测到HCV蛋白阳性细胞。上述结果表明,野生型FL-J6JFH和NS5A置换后的FL-J6JFH/J4NS5A都能在Huh7.5.1细胞中长时间有效复制,FL-J6JFH/J4NS5A的复制能力较野生型有很大程度降低。收集FL-J6JFH/J4NS5A和FL-J6JFH转染细胞的上清(d3、d 5、d 8、d 12),感染na?ve Huh-7.5.1细胞,72h后免疫荧光法检测HCV蛋白阳性细胞,结果都可见HCV蛋白的表达,但FL-J6JFH/J4NS5A的蛋白表达水平要显著低于野生型FL-J6JFH。上述结果表明,FL-J6JFH和FL-J6JFH/J4NS5A转染细胞后,都能产生具有感染性的病毒颗粒(HCVcc)。不同的是,FL-J6JFH NS5A被置换后,病毒的复制、蛋白的翻译以及感染性病毒颗粒的分泌都显著降低,说明了JFH NS5A在FL-J6JFH体外高效复制中起重要作用。野生型FL-J6JFH转染后第9天始,可见明显的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),在细胞培养物中持续出现大量不贴壁的细胞,且细胞生长速度变缓并批量死亡。而嵌合体转染的细胞内没有这种效应。这也说明FL-J6JFH/J4NS5A产生的病毒滴度要低于野生型,嵌合体无CPE效应,因此可能更加接近天然的HCV病毒颗粒,为我们下一步工作提供了一个理想的实验平台。二、NS5A定点突变对置换后HCV复制能力下降的代偿作用采用人工定点突变的方法,将HCV NS5A的2197位上的丝氨酸突变成脯氨酸(Ser-Pro),2201位上丝氨酸缺失(deletion),和2204位上的丝氨酸突变成异亮氨酸( Ser-Ile ),构建四个突变复制子,即FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P)、FL-J6JFH/J4NS5A(S2201del)、FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2201del)和FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I)。将四个突变子和未突变的FL-J6JFH/J4NS5A体外转录后分别转染Huh7.5.1细胞,转染后第10天收集细胞进行RNA和蛋白检测。用HCV特异性引物进行PCR定性检测,在转染后第10天所有的复制子都检测到了特异性大小的HCV条带。荧光定量PCR检测突变前后复制子RNA转染细胞内HCV RNA的水平。FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I)和FL-J6JFH/J4NS5A(S2201del)转染细胞内RNA水平相较突变前有了提高。RNA水平最高组为FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I),第8天细胞内RNA水平为5.3×105GE/ug RNA,为突变前FL-J6JFH/J4NS5A第8天细胞内RNA水平的约120倍( 4.2×104GE/ug RNA )。FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P)和FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2201del)与突变前相比,细胞内RNA水平有所下降,其中最低为FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2201del),转染细胞后第8天,为3.3×103 GE/ug RNA,约为RNA水平最高组的1/160。免疫荧光染色检测转染细胞内HCV NS5A蛋白的表达情况,与突变前FL-J6JFH/J4NS5A相比,突变后的FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P)和FL-J6JFH/J4NS5A (S2197P+2201del)的HCV阳性细胞数明显减少,最少的为FL-J6JFH/J4NS5A (S2197P+ 2201del),在转染后第5天和第10天,几乎不可见阳性细胞。FL-J6JFH/J4NS5A(S2201del)的阳性细胞情况与突变前相似。表达HCV蛋白阳性细胞数最高的是FL-J6JFH/J4NS5A (S2197P+S2204I),第10天阳性细胞数约占整个细胞数的60%,远远高于突变前的5%。以上结果表明,J4的NS5A的2197,2201,2204位点上丝氨酸对HCV的复制和蛋白产物的生成有着重要的作用,在一定程度上决定着HCV的复制和蛋白翻译的能力。三、Core区基因能置换对FL-J6JFH病毒复制影响的研究采用基因置换的方法(Gene swapping),用我国HCV感染最常见的基因型(1b型J4株)的core区基因替换了FL-J6JFH的相应基因,构建基因型间嵌合体FL-J6JFH/J4core。将FL-J6JFH1、FL-J6JFH/J4NS5A和FL-J6JFH/J4core用Xbal1线性化后,体外转录成RNA,用脂质体介导转染Huh7.5.1细胞。转染细胞传代培养,转染后第5天用FQ RT-PCR方法检测转染细胞内HCV RNA水平。结果表明,FL-J6JFH/J4core的RNA水平约为5.6×105GE/ug RNA,与野生型FL-J6JFH1相当,而FL-J6JFH/J4NS5A转染后第5天细胞内RNA水平仅为4.3×104GE/ug RNA。转染后第8天,免疫荧光检测HCV阳性细胞,野生型FL-J6JFH1的阳性细胞数在细胞总数中的比例达到了50%,而FL-J6JFH/J4core的值约为30%多,低于core置换前的野生型FL-J6JFH1株的水平。RNA转染的细胞第8天阳性细胞数比例最少的是FL-J6JFH/J4NS5A,不足5%左右,提示结构基因和非结构基因产物之间的相互作用,会影响HCV的复制水平。收集转染后第8天细胞上清,孵育正常Huh7.5.1细胞,免疫荧光方法检测HCV阳性细胞。结果,与对照FL-J6JFH1相比,FL-J6JFH/J4core的阳性细胞数有了一定程度上的减少。提示core蛋白的替换会影响HCV感染性病毒的包装或释放。四、包膜区替换对HCV细胞亲嗜性影响的研究生长致密的单层BHK-21细胞按0.001MOI接种乙型脑炎病毒(JEV)疫苗株SA14-14-2,培养72h左右至细胞发生明显的病变效应(CPE),用JEV E单抗免疫荧光检测,结果阳性细胞数占总细胞数的接近70%。收集感染细胞的上清,抽提RNA后,用RT-PCR的方法,扩增出包含JEV prM和E区基因的片段。再用重叠延伸PCR、酶切连接等方法,平行替换同属黄热病毒HCV 2a型FL-J6JFH的E区,构建了HCV/JEV嵌合复制子。HCV/JEV嵌合子体外转录,经脂质体转染BHK-21细胞,免疫荧光检测证实嵌合病毒HCV/JEV能在BHK-21细胞中表达蛋白,RT-PCR检测证实转染细胞中有病毒RNA的复制。嵌合病毒的蛋白表达和RNA复制水平明显低于J6JFH1病毒。HCV/JEV在BHK-21细胞中能否产生感染性病毒颗粒还在进一步实验中。小结:1.与野生型FL-J6JFH相比,FL-J6JFH/J4NS5A的复制能力显著降低,表明NS5A是影响HCV复制的重要因子。FL-J6JFH/J4NS5A转染细胞后不发生细胞病变效应,可能更加接近天然存在的HCV,可以作为进一步研究影响HCV NS5A的关键决定因子的实验平台。2.采用人工定点突变的方法,构建HCV NS5A上氨基酸替换或缺失的四个突变复制子,即FL-J6JFH/J4NS5A ( S2197P )、FL-J6JFH/J4NS5A ( S2201del )、FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2201del)和FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I)。比较4个突变子与FL-J6JFH/J4NS5A在细胞内复制水平的差异,发现了高复制能力的FL-J6JFH/J4NS5A(S2197P+S2204I),说明关键氨基酸的替换能够有效对NS5A置换后复制能力的下降起到一定的代偿作用。3.用J4 core平行替换野生型的FL-J6JFH1,得到了FL-J6JFH/J4core复制子,并对其在Huh7.5.1细胞内复制、翻译水平以及产生感染性病毒颗粒能力的改变进行了探讨。4.用同属黄热病毒的乙型脑炎病毒的prM和E区(决定细胞亲嗜性),平行替换HCV 2a型FL-J6JFH1的E基因,构建了嵌合的HCV/JEV复制子,并对其在BHK-21细胞内的复制和蛋白表达进行了检测,为建立HCV跨种感染的细胞模型做出了一种新的尝试。