弹性蛋白酶(elastase)是以水解不溶性弹性硬蛋白为特征的一类广谱蛋白水解酶,在食品、医药、日化及环保领域有重要的开发前景。目前国内弹性蛋白酶的生产方法主要是从动物的胰脏中提取,受到脏器材料及生产工艺的限制,成本较高,产量较低,不能满足市场需求,限制了弹性蛋白酶的应用推广。国内外广泛开展利用微生物发酵生产弹性蛋白酶,在一定程度上缓解了工业用酶,如肉类嫩化剂、化妆品添加剂等方面的需求,但作为医用生化药物仍然有很大的局限。这主要是由于微生物发酵生产的弹性蛋白存在安全性方面的问题,另外不同微生物来源的弹性蛋白酶性质有一定差别,距离医用生化药物商品生产有一定的距离。鉴于以上的原因,本研究利用基因工程技术,通过反转录克隆了人肾脏组织中的弹性蛋白酶2B(elastase 2B,ELA2B)基因,利用大肠杆菌和毕赤酵母表达系统对其进行表达,为将来大规模生产安全的人源弹性蛋白酶打下基础,同时对人源ELA2B蛋白结构研究和弹性蛋白酶性质研究提供了实验材料。本试验采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从人体肾脏组织中提取的总RNA中扩增得到了ELA2B基因,构建pGEM-T easy/ELA2B重组质粒。经序列分析,ELA2B基因由809个核苷酸组成,编码一个由269个氨基酸组成的多肽,包括编码16个氨基酸的信号肽,12个氨基酸的前导肽和241个氨基酸的成熟肽。本试验成功构建了原核重组表达质粒pET30a/ELA2B和真核重组表达质粒pPIC9K/ELA2B,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母GSll5进行表达研究。对重组大肠杆菌进行诱导表达,IPTG诱导后,做SDS-PAGE分析,得到大小约为28kDa的特异性条带。但经过包涵体复性在弹性蛋白酶活性检测平板上未发现有代表弹性蛋白酶作用的透明圈产生。将重组质粒pPIC9K/ELA2B线性化,通过电转化将目的基因转入毕赤酵母GSll5后,筛选到101个转化子,在经G418筛选,获得16株含高拷贝的重组酵母转化子。选择一株进行甲醇诱导表达,酪蛋白平板检测发现发酵液上清可以水解酪蛋白,初步证实表达产物具有生物活性。经SDS—PAGE电泳检测,得到大小约为28kDa的目的条带。本实验成功克隆了人源弹性蛋白酶2B基因,并构建了原核和真核表达载体,进行蛋白表达。使发酵生产人源弹性蛋白酶成为可能,同时也为进一步研究弹性蛋白酶的结构和生物活性奠定了基础。