研究背景脑性瘫痪(CerebralPalsy,CP)简称脑瘫,也称为脑性麻痹,是一组持续存在的中枢性运动和姿势发育障碍、活动受限的症候群,多由于发育中的胎儿或婴幼儿的脑部非进行性损伤所致,主要表现为运动障碍,伴或不伴有感知觉和智力缺陷。全世界患病率约为2.0~3.5%。,我国发病率随地区的不同为1.8~4.0%。,并且有逐年上升的趋势。CP是造成儿童残疾最为严重的疾病之一,也是伴随患者终生的疾病,给家庭和社会带来了沉重的精神和物质负担,因此寻找治疗和改善CP的方法显得尤为迫切。CP的脑部病理改变主要是脑室周围白质损伤,包括脑室周围白质软化症(PVL)、脑室内出血以及弥漫性髓鞘化障碍。是由于发育中的大脑在产前、产时和或产后受到损伤导致。目前CP的发病机制被认为是炎性反应和缺血缺氧共同作用导致,因此我们推测治疗CP的关键是缓解炎症反应,促进血管新生,修复受损组织。其中前期为应急修复阶段,此阶段以抗炎修复为主,巨噬细胞由促炎状态的M1型分化成抗炎修复的M2型并发挥作用;后期为血管新生阶段,此阶段血管内皮细胞在生长因子的作用下发生迁移和增殖,进而促进新生血管的生成,建立侧枝循环缓解缺血缺氧的组织。巨噬细胞通过调节其M1/M2型分化在平衡免疫系统的炎症和抗炎反应扮演重要角色,研究证实M2型巨噬细胞具有促进神经细胞的修复作用,并通过分泌血管内皮生长因子(VEGFA),促进血管内皮细胞增殖和迁移,进而发生血管新生和建立侧枝循环,但其中是由哪些基因调节抗炎修复和血管新生的作用仍然不明。我们在临床工作中发现穴位注射中药天麻素对于CP患者的临床指标有显著改善作用。本文以此为切入点,通过基因芯片筛查CP的疾病基因表达量变化,探讨天麻素对于巨噬细胞M1/M2型调节免疫炎性反应的机制,以及VEGFA促进血管内皮细胞增殖和迁移的作用机制和途径,为中药天麻素在临床上治疗CP的应用提供科学理论依据。研究目的本研究通过基因芯片技术筛选出与CP有高相关性的基因,进而探讨了 BCL6基因在天麻素调节巨噬细胞参与炎症反应的重要性,以及AP-1家族基因调节血管内皮细胞参与血管新生的作用途径,探究中药天麻素调节免疫炎性反应的机制以及对CP治疗方法的研究。研究方法实验一:CP患者基因表达谱的研究。招募44例先天性脑瘫、18例后天性脑瘫以及30例正常儿童。采集所有研究对象的外周血,进行RNA抽提和纯化,经过质检合格后,使用Affymetrix公司开发的PrimeView Human Gene Expression芯片进行扫描。将结果进行分析找出与CP疾病相关的mRNA表达谱。实验二:天麻素对于CP的疗效评价以及作用靶点。通过分析CP患者的临床资料,统计中药天麻素穴位注射治疗患者的内收肌角、粗大运动功能评分(GMFM-66)以及精细运动功能评分(FMFM-45)的改变;并通过检测天麻素作用于M1型巨噬细胞的基因表达差异,确定天麻素在巨噬细胞参与炎性反应的关键作用靶点为BCL6基因。实验三:BCL6基因对天麻素作用于巨噬细胞的影响。通过观察天麻素对于M1及M2型巨噬细胞的作用,以及敲除BCL6基因后该作用的变化,探讨其发挥抗炎抗凋亡作用的机制。实验四:VEGFA作用于血管内皮细胞对AP-1家族基因表达的影响及其信息传递通路。由于M2型巨噬细胞通过分泌VEGFA刺激血管内皮细胞的活化,进而推动新生血管的生成。因此通过观察VEGFA对于血管内皮细胞的AP-1家族基因表达的影响,探究其转录机制和发挥作用的信息传递通路。实验五:VEGFA通过AP-1家族对于血管内皮细胞功能的影响。通过观察VEGFA对于血管内皮细胞的作用,以及敲除AP-1家族基因后该作用的变化,观察其对血管内皮细胞的迁移、细胞增殖以及细胞周期的影响。研究结果1.和正常对照组相比,CP病人组(无论先天CP还是后天CP组)有1008个基因表达有差异,其中214个基因表达升高,794个基因表达降低。基因SRSF3、ELF2、BCL2L11、BCL6、CSNK1A1 表达显著上升 4 倍以上,UQCRB、PFDN4、LSM3、CLEC2B表达显著降低5倍以上,RAD23B仅在后天CP组显著降低。2.通过对比CP患者天麻素穴位注射组和生理盐水穴位注射组治疗前后,以及天麻素穴位注射CP组以及非脑瘫型神经疾病组治疗前后临床指标的变化,证实天麻素穴位注射对于缓解CP患者的内收肌高张力,提高GMFM-66以及FMFM-45评分有改善效果,且疗效显著优于非脑瘫型神经疾病患者;进而通过巨噬细胞实验,发现天麻素可以调节参与炎症反应为主的M1型巨噬细胞的BCL6基因表达上升。3.天麻素作用于M1型巨噬细胞使其BCL6基因表达量升高,对M2型则无此作用。此外天麻素可以诱导M1型巨噬细胞分化为M2型,同时使受到氧化应激刺激的巨噬细胞的细胞活力升高以及凋亡程度降低,但当敲除BCL6基因后,该诱导作用和调控细胞活性和细胞凋亡的能力消失。4.VEGFA显著提高血管内皮细胞AP-1家族中c-fos、c-jun、JunB、JunD的mRNA及蛋白的表达,并随着作用的时间改变。VEGFA上调AP-1表达的作用主要是通过MEK1、p38-MAPK、PKC以及IGF1R信号传递通路,而不通过PI3K通路。5.VEGFA可以促进血管内皮细胞的迁移和增殖,并提高细胞周期蛋白CyclinD1的表达。但当抑制AP-1蛋白活性后,细胞的迁移和增殖受到抑制,CyclinD1表达下降;当敲除AP-1家族基因JunB、JunD表达后,细胞的迁移受到抑制,细胞的增殖不受影响,细胞的CyclinD1表达下降。结论1.与正常对照组相比,先天性脑瘫和后天性脑瘫表达异常的基因与炎症、缺血缺氧、血管新生、细胞增殖以及血管完整性的维持有关,提示脑瘫的病理机制确实与炎性反应和缺血缺氧反应共同相互作用有很大关联性。2.天麻素穴位注射疗法对于缓解脑瘫疾病内收肌角、提高GMFM-66以及FMFM-45评分的疗效显著,且明显高于非脑瘫型患者,提示天麻素发挥作用的机制与脑瘫的发病机制有共同通路或靶点。3.天麻素可以诱导巨噬细胞由炎性反应为主的M1型分化为抗炎促修复为主的M2型,可以显著提高受到氧化应激刺激的巨噬细胞的活力,和降低其细胞凋亡的程度,且该作用是通过提高巨噬细胞的BCL6基因表达来介导的。4.M2型巨噬细胞通过分泌VEGFA刺激血管内皮细胞的活化,进而推动新生血管的生成。而VEGFA可以通过MEK1、p38-MAPK、PKC以及IGF1R信号传递通路显著提高血管内皮细胞AP-1家族成员的表达,并通过AP-1家族成员调控血管内皮细胞的迁移、增殖和细胞周期,进而影响血管新生,建立侧枝循环。