论文部分内容阅读
水稻杂种不育是植物合子后生殖隔离的一种表现形式。栽培稻(Oryza sativa)籼粳两个亚种间杂种不育普遍存在,给亚种间杂种优势的利用带来了很大困难。广亲和品种(WCV)是一类能与籼稻和粳稻杂交都表现可育的特殊种质资源。f5是水稻第5染色体上控制亚种间杂种花粉育性和小穗育性的主效QTL。本研究内容之一是以图位克隆为基础,结合遗传分析、比较测序、基因表达分析等方法克隆f5基因。分子标记技术是分子生物学研究中的重要手段之一。传统的分子标记技术如RFLP和SSR检测通量低、费时费力,用这些标记构建的连锁图标记密度低,在QTL分析等研究中不能提供足够的信息。以基因芯片和测序技术为基础的新型分子标记技术能够实现大规模高通量分子标记操作。本研究内容之二是以本室研究最多的群体——珍汕97／明恢63重组自交系(RIL)为材料,分别利用表达谱芯片数据获得的SFP (Single Feature Polymorphism)标记、以群体测序数据获得的SNP标记构建高密度遗传连锁图。与传统的RFLP/SSR图谱相比,测序SNP图谱分辨率高、准确性好,在QTL分析中具有很大的优势。本研究主要结果如下：1.利用12个水稻品种的不完全双列杂交、三交群体02428/Nanjingl 11//Balilla,籼粳F2群体、卢近等基因系ZS97(f5-Du/f5ZS)等各种组合分析发现,f5基因影响杂种小穗育性,在不同组合中效应大小有差异。结合前人研究结果,利用近等基因系ZS97(f5-Du/f5-ZS)与Balilla杂交后代群体初步将f5定位于日本晴BAC P0008A07上78-91 kb约13 kb区域,该区域有2个候选基因,ORF1和ORF2。ORF1编码未知蛋白,ORF2编码含锚蛋白重复序列ANK结构域的蛋白。2.对不同品种ORF1和ORF2及两侧约100 kb基因组区域进行了比较测序,发现在卢位点存在三种等位基因型：籼型、粳型和中性(广亲和型)。相同等位基因型品种间序列一致,不同等位基因型品种间序列差别很大,不仅存在大量SNP和InDel,还存在基因拷贝数和重复序列的差别。基因表达分析表明,ORF1和ORF2两个基因在籼稻和粳稻幼穗中高表达,而在广亲和品种全生育期都检测不到表达。3.利用近等基因系ZS97(f5-Du/f5-ZS)群体筛选重组单株与近等基因系Balilla(S5-Du/S5-Du)测交发现,在ORF1和ORF2两侧的重组家系小穗育性分离明显并符合预期,但ORF1和ORF2之间的重组家系表型波动大,并出现相互矛盾的情况。利用近等基因系Balilla(f5-NJ/f5-Ba)群体筛选重组单株发现ORF 1和ORF2之间的重组家系基因型混乱,标记在日本晴基因组上的物理位置和遗传位置不一致。推测f5复杂的遗传机理可能与f5区间复杂的序列结构有关。4.利用204个InDel标记构建Balilla/Nanjingll F2群体全基因组遗传连锁图,并对等位基因偏分离、花粉育性和小穗育性进行了全基因组分析。共鉴定和验证得到了5个偏分离位点、2个花粉育性位点(S-c和f5)和3个小穗育性位点(S-c,f5和S5)。f5位点对小穗育性和花粉育性效应都是最大的,但是该位点在Balilla/Nanjingll F2群体以及其它籼粳F2群体中都没有明显偏分离。5.利用包含110个家系的RIL群体及亲本珍汕97和明恢63发芽72小时幼苗的表达谱芯片数据开发SFP标记构建遗传连锁图。利用中值平滑、PAM聚类、Z得分公式等方法鉴定SFP标记,并对所得标记进行筛选,共得到1632个SFP标记。加上23个填补gap的PCR标记共1655个标记合并成601个重组bin。构建的连锁图全长1459 cM,平均每个bin 2.43 cM。利用该方法鉴定出了RIL群体正确的亲本珍汕97和明恢63,并发掘了鉴定和区别亲本的PCR分子标记。6.利用Illumina/Solexa新一代测序技术对包含241个家系的RIL群体进行了全基因组低覆盖度测序(约0.06倍),共获得270,820个高质量SNP,相当于基因组1SNP／1.37 kb。利用这些SNP对所有RIL进行基因分型,排除SNP基因型和以前的RFLP/SSR基因型不一致、杂合基因型比例异常偏高和重复冗余的家系,最后剩余210个家系。这210个家系基因型图谱共获得1619个重组bin,构建遗传连锁图总长1625 cM,平均1.0cM/bin,相当于基因组230 kb。与传统的RFLP/SSR连锁图比较,测序SNP bin图不仅密度高而且准确性高。利用测序SNP bin图可以将水稻中控制紫色稃尖的基因OsCl、控制粒长QTL GS3和控制粒宽QTL GW5/qSW5准确限定到<200 kb范围内。对产量及产量构成因子性状分析发现,高密度测序SNP bin图比RFLP/SSR图能够鉴定更多的QTL特别是千粒重QTL,并且鉴定的QTL更准确更精细,表明在QTL分析中的检测能力和检测精度等方面具有优势。