论文部分内容阅读
目的:提取小鼠AECⅡ细胞，建立原代AECⅡ细胞PQ中毒模型，并观察Sirt1、Nrf2表达量的改变与PQ作用的剂量、时间效应关系，探求两者之间的联系。观察Nrf2蛋白的乙酰化水平、稳定性与Sirt1表达的关系，观察Nrf2与ARE的结合活性改变与PQ作用的剂量、时间效应关系。观察不同剂量、不同时间PQ作用后，细胞氧化应激指标的改变及细胞凋亡的改变。 方法: 1.低浓度胰酶联合Ⅰ型胶原酶消化法提取小鼠AECⅡ细胞，台盼蓝染色检测细胞活力，免疫荧光鉴定所提取细胞 2.以PCR、Western Blot、Co-IP方法检测不同剂量(400μM、800μM、1200μM、1600μM作用24h)、不同时间（800μ M作用6h、12h、24h、48h）PQ作用后小鼠AECⅡ细胞Sirt1、Nrf2基因和蛋白水平表达的改变及Nrf2乙酰化水平的变化，EMSA法检测不同剂量、不同时间PQ作用后小鼠AEC-Ⅱ Nrf2与ARE结合活性的改变，应用放线菌酮检测Nrf2蛋白稳定性的改变。 3.化学比色法检测不同剂量(400μ M、800μ M、1200μ M、1600μ M作用24h)、不同时间（800μ M作用6h、12h、24h、48h）PQ作用后小鼠AEC-Ⅱ氧化应激指标SOD、CAT、GSH、MDA的改变，ELISA法检测不同剂量、不同时间PQ作用后小鼠AEC-ⅡHO-1的表达改变，caspase-3、caspase-9活性试剂盒检测不同剂量、不同时间PQ作用后小鼠AEC-Ⅱcaspase-3、caspase-9活力的改变，流式细胞计数检测不同剂量、不同时间PQ作用后小鼠AEC-Ⅱ凋亡比例的改变，Western Blot检测不同剂量、不同时间PQ作用后小鼠AEC-ⅡCytochrome c蛋白表达改变。 结果: 1.经低浓度胰酶联合Ⅰ型胶原酶消化法分离、纯化小鼠AECⅡ，每只小鼠可平均获得5×106个细胞，台盼蓝染色证实细胞活力90％，免疫荧光特异性蛋白染色证实所提取细胞为小鼠AECⅡ。 2.不同时间、不同剂量PQ作用后Sirt1、Nrf2的基因及蛋白水平的变化保持一致，均呈现先升高后降低的趋势，分别在12h、800μM时表达达到高峰，与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。Nrf2的乙酰化水平与Sirt1蛋白的表达水平呈现相反趋势。不同时间、不同剂量PQ作用后Nrf2与ARE的结合活性同样呈现先升高后降低的趋势，分别在24h、800μM时结合活性达到峰值，与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。稳定性结果显示，Sirt1的存在，增加了Nrf2的稳定表达。 3.PQ作用后抗氧化酶SOD、CAT的活力及抗氧化物GSH的含量随作用时间延长先降低而后回升;随着PQ作用剂量的加大，抗氧化酶SOD、CAT的活力及抗氧化物GSH的含量先下降后有所回升更大剂量后再次下降，与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。HO-1的表达则随着PQ作用浓度的增大递增，随作用时间延长先升高后降低，与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。PQ作用后，MDA含量呈现时间、剂量依赖性增加，与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。caspase-3、caspase-9的活力随PQ作用时间延长、剂量加大呈现先升高后降低的趋势，与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。PQ作用后细胞凋亡随时间、剂量的增加而增多，但长时间、大剂量作用后，细胞死亡数超过凋亡数。线粒体内Cytochrome c蛋白呈现时间、剂量依赖性降低，胞质中其含量与细胞凋亡趋势一致。 结论: 1.PQ作用于小鼠AEC-Ⅱ后，Sirt1表达量升高，通过其去乙酰化作用于Nrf2，降低了Nrf2的乙酰化水平，使得Nrf2蛋白的表达量升高，同时使其稳定性增强。 2.PQ作用于小鼠AEC-Ⅱ后能够激活线粒体调控的细胞凋亡途径，使细胞凋亡增多，凋亡蛋白表达升高，脂质过氧化损伤加重。PQ作用后Nrf2在细胞内表达量升高、稳定性增强，并且与ARE特异性结合的能力增强，继而调节位于下游的抗氧化物HO-1、SOD、CAT、GSH的表达，应对PQ对细胞的氧化应激损伤。